Antibiotická rezistence bifidobakterií k metronidazolu

Bc. Hana Ludvíková

Master's thesis

Antibiotic resistance of bifidobacteria to metronidazole

Abstract:

Bifidobakterie jsou součástí střevní mikrobioty a existují vědecky doložené výsledky, že mají pozitivní vliv na zdraví hostitele. To by mohlo být využito při léčbě antibiotiky, aby se předešlo střevní dysbióze. Metronidazol je často využívané antibiotikum při léčbě Crohnovy choroby, střevních zánětlivých onemocnění nebo se podává k profylaxi vzniku infekcí při operacích. Cílem této diplomové práce bylo přinést nové experimentální poznatky k problematice rezistence bifidobakterií k metronidazolu. Testování probíhalo na čistých kulturách bifidobakterií a dále byly v laboratorních podmínkách kultivovány vzorky stolice spolu s metronidazolem. Na získaných izolátech bifidobakterií probíhala detekce citlivosti na metronidazol diskovou metodou. V této práci byla analyzována dříve naměřená data pomocí diskové difúzní metody s daty nově naměřenými prostřednictvím e-testu. Při testování in vitro bylo zjištěno, že se bifidobakteriální kmeny liší nejenom z hlediska citlivosti na úrovni druhu, ale byla detekována i kmenová variabilita. U testování diskovou difúzní metodou při koncentraci 5 μg i 50 μg metronidazolu byla zaznamenána častá rezistence. Celkem bylo otestováno 63 bifidobakteriálních kmenů (36 typových náležící 36 druhům/podruhům a 27 divokých kmenů lidského původu náležícím k druhům B. adolescentis, B. animalis ssp. lactis, B. bifidum, B. catenulatum, B dentium, a B longum ssp. longum). Pokud kmen vykazoval rezistenci k 50 μg metrondiazolu, tak byl rezistentní i na celé koncentrační škále e-testu (0,016 - 256 μg). Koncentrace 50 μg se zdá být vhodnou pro screening rezistence k metronidazolu diskovou metodou. V případě testování antibiotické citlivosti diskovou metodou byl zjištěn pozoruhodný výsledek. V inhibičních zónách spontánně vznikaly kolonie rezistentních mutantů. Testování těchto kolonií pomocí diskové metody i e-testu rezistenci potvrdilo. Testováním fekálních vzorků kultivovaných s metronidazolem bylo dosaženo dalšího zajímavého poznatku. Potvrdil se výsledek z laboratorního testování čistých kultur a to, že můžou vznikat mutanti v inhibiční zóně. Byla potvrzena druhová a kmenová variabilita v rámci bifidobakterií. Navíc testované kmeny Bifidocterium animalis ssp. lactis, které se nejčastěji používají jako probiotické kmeny, se chovaly jinak než ostatní bakterie a vykazovaly adaptaci na metronidazol, rezistenci získávali postupně. Přítomnost genu na rezistenci k 5-nitroimidazolovým antibiotikům byla nalezena ve více genomech typových kmenů lidského nebo zvířecího původu. K dispozici byla genomová data pro 13 testovaných typových kmenů. Nicméně přítomnost tohoto genu nekorespondovala s daty detekovanými in vitro pomocí diskové difúzní metody a e-testu. Rezistence byla detekována pouze u 4 kmenů ze 13. Abychom byli schopni daný gen detekovat u divokých izolátů bylo by třeba vyvinout funkční primery pro PCR detekci. To se nepodařilo, protože docházelo k nespecifickým reakcím. Z výsledků je patrné, že rezistence vůči metronidazolu je u bifidobakteriálních druhů a kmenů celkem běžná. Je zřejmé, že mechanismů rezistence bude více, a že studium uvedené problematiky může přinést další zajímavé výsledky.

Abstract:

Bifidobacteria are a part of intestinal microbiota and there are scientifically documented results that bifidobacteria have positive effect on health of its host. That could be used during an antibiotic treatment to prevent intestinal dysbiosis. Metronidazole is often used as an antibiotic for the treatment of Crohn's disease, inflammatory bowel diseases or for the prophylaxis of surgical infections. The aim of the thesis was to bring new experimental knowledge concerning the issue of bifidobacterial resistance to metronidazole. Testing was performed on pure cultures of bifidobacteria. Furthermore, there were faecal samples cultured together with metronidazole under laboratory conditions. Sensitivity to metronidazole was being detected in the obtained bifidobacterial isolates using the disk method.In this thesis the data previously acquired using the disk diffusion method were analysed and compared to data newly measured by e-test. In vitro testing showed that bifidobacterial strains differ not only in susceptibility at the species level, but also in its strain variability. Frequent resistance was noted during disk diffusion testing with both metronidazole concentrations of 5 μg and 50 μg. There were 63 strains tested at total (36 type strains belonging to 36 species / subspecies and 27 wild strains of human origin belonging to following species: B. adolescentis, B. animalis ssp. lactis, B. bifidum, B. catenulatum, B dentium, a B longum ssp. longum. In cases in which the strain was resistant to 50 μg of metronidazole, the resistance was also detected throughout the entire concentration scale of e-test (0,016 – 256 μg). The concentration of 50 μg appears to be suitable for screening for metronidazole resistance by the disk method. In case of testing antibiotic susceptibility by disk diffusion method a noteworthy outcome was recorded. The mutant colonies that were resistant to metronidazole were detected in inhibition zones. The testing of the colonies by both disk diffusion method and e-test confirmed such resistance. The testing of faecal samples which were cultivated with metronidazole brought yet another interesting piece of knowledge. The result of laboratory testing of clean cultures was validated. The mutant colonies can originate in an inhibition zone. The variability of species and strains of bifidobacteria was proven. Furthermore, the tested strains of Bifidocterium animalis ssp. lactis, which are most often used as probiotic strains, behaved differently from other bacteria and showed signs of adaptation to metronidazole, acquiring resistance gradually. The presence of a gene for resistance to 5-nitroimidazole antibiotics was recorded in multiple genomes of type strains of human or animal origin. Genomic data were available for 12 types of tested strains. However, the presence of this gene did not correspond to the data detected in vitro using the disk diffusion method and e-test. The antibiotic resistance was detected only for 3 strains out of 12. In order to be able to detect such gene in wild isolates, it would be necessary to develop functional primers for PCR detection. That was, however, not possible because of non-specific reactions during testing. The results show that resistance to metronidazole is in bifidobacterial species and strains quite common. It is clear that there will be more mechanisms of resistance and that studying this issue may yield other interesting results.

Keywords

bifidobakterie, PCR, MIC, rezistence, mutace, nitroimidazol

Keywords

nitroimidazole, bifidobacteria, MIC, PCR, resistance, mutation

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Věra Neužil Bunešová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food Quality and Processing of Agricultural Products