Structural Dynamics of the Catalytic RNA: Computational Study of the Hepatitis Delta Virus Ribozyme

Mgr. Maryna Krasovska, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Disertační práce je zaměřena na studium strukturní dynamiky ribozymu Hepatitis Delta Viru (HDV), který využívá jednu ze svých vlastních bází pro obecnou acid/base katalýzu. Cis-působící genomický HDV ribozym byl zkoumán pomocí molekulární dynamiky (MD) na nanosekundové časové škále a výzkum poskytl následující hlavní výsledky. 1. Studium dynamiky aktivního místa a vliv modifikace C75 nukleobáze: Neprotonizovaný C75 dočasně vytvoří vodíkovou vazbu mezi C75(N3) a U-1(O2'), což je doprovázeno dalšími konformačními změnami, které jsou potřebné pro tvorbu konfigurace “in-line attack” během štěpící reakce kde C75 funguje jako obecná báze. Tyto výsledky jsou v souladu s úlohou C75 jako obecné báze během katalýzy kde hydratovaný Mg2+ funguje jako obecná kyselina. Avšak nelze vyloučit alternativní mechanismus reakce, který zahrnuje C75H+ jako obecnou kyselinu. 2. Kompaktní terciární struktura HDV ribozymu obsahuje několik významných míst s negativním elektrostatickým potenciálem (ESP). Tato místa jsou obsazena kationty. Vazebná místa pro Na+ ionty pozorované v simulacích jsou ve shodě s vazebnými místy pro Tl+ v krystalové struktuře C75U prekursoru HDV ribozymu. Nejvíce negativní ESP místa a nejvýznamnější vazebná místa kationtů se nachází v katalytické kapse. 3. Simulace ukázaly, že schopnost aktivního místa vázat katalyticky kation Mg2+ je určeno ESP a velikostí katalytické kapsy. Velmi nízké hodnoty ESP a současně větší katalytická kapsa prekurzoru jsou výhodné pro vázání Mg2+ iontů. Naproti tomu v katalytické kapse C75H+ protonizovaného prekurzoru a produktu vázání Mg2+ iontů nebylo pozorované, což je v souhlasu s krystalografickými a mechanistickými studiemi. 4. Simulace prováděné bez Mg2+ kationtů ukázaly simultánní vázání dvou Na+ kationtů v katalytické kapse. Toto pozorování bylo plně potvrzeno nezávislou krystalografickou studií. 5. Identita N-1 base v O5'-sekvenci měla významný vliv na strukturní dynamiku aktivního místa a rychlost štěpení. Nemodifikovaný U-1 HDV ribozym ukazoval nejvíce kompaktní katalytické jádro, včetně nejvíce stabilního helixu P1.1, páru bází G1:U37 a terciární struktury A-minor motivu. Aktivita ribozymu klesa v následujícím pořadí U-1> C-1> A-1> G-1 s 25-násobnou ztrátou aktivity od U-1 do G-1. 6. Deprotonizace A(n-1)C+GC-n tetrády měla za následek rozpad tetrády a podstatný ohyb dvoušroubovice P4, což bylo inhibováno kationty Na+. Tyto konformační změny neovlivnily na dané časové škále katalytické jádro. 7. Nespárovaný nukleotid G76, který tvoří stacking interakce z G76 ze symetrické molekuly HDV ribozymu ve všech dostupných krystalových strukturách, vykazoval významnou konformační flexibilitu a tvořil pevnou interakci s helixem P1 v MD simulacích. Simulace ukázaly, že identita a pozice N76 je důležitá pro strukturní dynamiku aktivního místa. V rámci této práce byly také studovány elastické vlastnosti helixu 44 (z malé ribozomální podjednotky organismu Thermus thermophilus) a kanonické A-RNA. Simulace ukázaly významné izotropní ohyby u obou těchto systémů. Pozorovaný rozsah ohybů v simulacích byl plně v souladu z krystalografickými a kryoelektronovými studiemi. Dále, pomocí MD simulací byla studována struktura a dynamika P-motivu, který obsahuje specifickou terciální interakci v malém žlábku. Výsledky disertační práce ukazují že MD simulace představují cenný nástroj pro kvalitativní studium strukturní dynamiky a konformačních substavů, které se uplatňují při katalýze ribozymu. MD simulace poskytují základ pro další experimentální studie a doplňují statický popis struktury získaný pomocí rentgenové krystalografie. Výsledky MD simulací lze využít při studiu reakčních mechanismů katalytické RNA pom

Abstract:

ocí pokročilých kvantově chemických metod.

Abstract:

The presented PhD thesis was focused on the structural dynamics of the HDV ribozyme, which utilizes one of its own nucleobases for general acid/base catalysis. The cis-acting genomic HDV ribozyme was studied by explicit-solvent molecular dynamics (MD) on nanosecond time scale, the following results were obtained. 1. Dynamics of the active site and influence of modifications of C75 nucleobase was studied. An unprotonated C75 shows a transient H-bond between C75(N3) and U-1(O2') accompanied by other conformational rearrangements, which are required for formation of in-line attack configuration in cleavage reaction that invoke C75 as the general base. These results are consistent with a role of C75 as the general base during catalysis complemented by general acid action of a hydrated Mg2+, although can not rule out alternative reaction mechanism which involves C75H+ as general acid. 2. The compact tertiary structure of the HDV ribozyme is associated with multiple regions of deep negative ESP, which lead to several cation-binding sites. Na+ binding sites observed in simulations are in excellent agreement with Tl+ binding sites in the crystal structure of the C75U precursor ribozyme. The most negative ESP and the most significant cation binding site is found at the catalytic pocket. 3. The simulations reveal that the ability of the active site to accommodate the catalytic Mg2+ is determined by the ESP and the size of the pocket. Very low ESP and larger catalytic pocket in the wild-type precursor structure are favorable for Mg2+ binding, while C75H+ protonated precursor and product ribozymes disfavor Mg2+ binding at the active site in agreement with crystallographic and mechanistic studies. 4. Simulations in absence of Mg2+ cations revealed simultaneous binding of two Na+ cations at the catalytic pocket. This observation was fully confirmed by independent x-ray study. It is the most prominent cation binding and long residency hydration site characterized by MD simulations so far. 5. Identity of the N-1 base of O5'-sequence have significant effect on the structural dynamics of the active site and cleavage activity. Wild-type U-1 HDV ribozyme shows the most tightly folded catalytic core, including the most stable P1.1 stem, G1:U37 wobble pair and A-minor tertiary structure. An order of activity of the N-1 mutants is U-1 > C-1 > A-1 > G-1 with a 25-fold activity loss from U-1 to G-1. 6. Deprotonation of A(n-1)C+GC-n quadruple results in disruption of the quadruple accompanied by significant bend of P4 helix, which is inhibited by Na+ cations. These conformational rearrangements do not affect the catalytic core on the simulation timescale. 7. Extruded nucleotide G76 which packs against G76 of a symmetry related HDV ribozyme in all available crystal structures samples a large conformational space and forms a long-residence perpendicular base quadruplet with stem P1 in MD simulations. Identity and position of N76 affects the structural dynamics of the active site. In the context of the present thesis the elastic properties of helix 44 from Thermus thermophilus and of a canonical A-RNA double helix were studied. The spontaneous motions seen in simulations of helix 44 achieve large degrees of bending seen in the X-ray structure and would be entirely sufficient to allow the dynamics of the upper part of helix 44 evidenced by cryo-electron microscopic studies. MD simulations were used to investigate the structure and dynamics of P-motif, specific tertiary interactions occurring in the G/U shallow groove. Present studies suggest that MD simulations represent a valuable tool to assess qualitatively the structural dynamics leading to conformational substates appropriate for ribozyme catalysis. MD simulations thus provide guidance for further experimental studies and complement the static pictures obtained by X-ray crystallography. Finally, the simulations pave the way for the application of advanced quantum chemical methods to probe the

Abstract:

reaction mechanism of catalytic RNAs.

Keywords

ribonucleic acid, hepatitis delta virus ribozyme, molecular dynamics, cation binding, hydration, backbone, A-minor motif, non-canonical base pair, in-line attack configuration, H-bond

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 3. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 27. 5. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Šponer, DrSc.
• Reader: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D., RNDr. Petr Jurečka, Ph.D., Ing. Filip Lankaš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry