In vitro cell bioassays for ecotoxicological assessment of environmental mixtures

Mgr. Tereza Štěpánková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Složky životního prostředí obsahují složité směsi látek přírodního i antropogenního původu s různou strukturou a potenciální biologickými účinky. Díky interakci jednotlivých sloučenin i přítomnosti neznámých nebo neanalyzovaných látek je hodnocení rizik těchto složitých směsí značně komplikované. Tato práce zkoumala použitelnost, citlivost a interpretační hodnotu specifických in vitro biotestů pro hodnocení kontaminace a biologické potence komplexních směsí v několika důležitých environmentálních matricích. Tyto in vitro testy odrážejí celkový potenciál komplexní směsi působit prostřednictvím určitého mechanismu účinku. Realizované studie byly zaměřeny na odhalení přítomnosti látek, které působí několika specifickými mechanismy: dioxinová aktivita, anti/androgenita, anti/estrogenita, anti/retinoidní aktivita a glukokortikoidní aktivita ve vybraných environmentálních matricích pomocí in vitro reportérových biotestů na savčích a kvasinkových buňkách. Zmíněné mechanismy účinku jsou důležité z hlediska negativního vlivu polutantů na živé organismy. Prezentované výsledky jsou založeny na šesti publikacích, které se zabývají komplexními environmentálními směsmi látek a aplikací in vitro biotestů. Tyto publikace přinesly důležité informace o přítomnosti látek se specifickými mechanismy účinku ve vybraných environmentálních vzorcích v České republice, kde byly tyto informace v minulosti velmi omezené. V první studii výsledky in vitro testů poukázaly na dopravu jako důležitý zdroj látek s dioxinovou a anti-hormonální aktivitou v půdách ovlivněných silniční dopravou. Ve studiích zaměřených na kontaminaci sedimentů z českých povrchových vod byly v jejich extraktech nalezeny látky s dioxinovou, anti/estrogenní a anti/androgenní aktivitou. Jejich koncentrace byly podobné jako v jiných oblastech Evropy. Některé ze studií provedených v mezinárodní spolupráci zkoumaly též sedimenty z jiných zemí. Studie zaměřená na silně znečištěné sedimenty z řeky Kymi ve Finsku ukázala dobrou korelaci výsledků in vitro testů na kvasinkových a savčích buňkách a chemických analýz. Biotesty také poukázaly na sezónní a regionální variabilitu znečištění v dynamickém říčním systému, které je důležité zohlednit v přípravě strategie monitoringu. In vitro biotesty citlivě indikovaly přítomnost endokrinně disruptivních látek ve studii zkoumající vliv kontaminovaných sedimentů na výskyt intersexu u korýšů, která pak byla odražena v in vivo účincích. Poslední dvě publikace v této práci přinášejí unikátní informace o přítomnosti bioaktivních látek v sinicích, řasách a komplexních vodních květech sinic. Estrogenní potence byly nalezeny jak u intracelulárních tak i u extracelulárních metabolitů sinic, což znamená, že tyto látky jsou produkovány do jejich okolního prostředí. Zjištěné hodnoty v ng/L mohou mít větší environmentální význam zejména v případech masového rozvoje vodních květů sinic. Studie v této práci prokázaly velmi dobrou využitelnost souboru specifických in vitro reportérových biotestů pro hodnocení biologických potencí komplexních směsí. Dokumentují, že informace ze specifických biotestů doplňují výsledky chemických analýz a umožňuje lepší charakteristiku stavu kontaminace ve vztahu k možným škodlivým účinkům.

Abstract:

Environmental compartments contain complex mixtures of compounds of both natural and anthropogenic origin with various structures and potential biological activities. Hazard evaluation and risk assessment of complex mixtures is complicated by the interactions of the individual chemicals as well as by the presence of unknown or not analyzed compounds. This thesis investigated the applicability, sensitivity and interpretation value of specific in vitro bioassays for the assessment of contamination and biological potencies of complex mixtures in several important environmental matrices. The in vitro bioassays reflect the total biological activities of complex mixtures acting through the same mechanism of action. The realized studies were focused on the characterization of the presence of compounds with several specific modes of action: dioxin-like activity, anti/androgenicity, anti/estrogenicity, anti/retinoid and glucocorticoid activity using in vitro reporter-gene bioassays based on mammalian and yeast cells. These modes action are important in the adverse influence of pollutants on living organisms. Presented results are based on six publications, which deal with the complex environmental mixtures and apply in vitro bioassays in research of several issues. The included papers brought important information on the presence of compounds with specific modes of action in selected environmental matrices in the Czech Republic, where this information was limited before. In the first study, the results of in vitro assays identified traffic as an important source of compounds with dioxin-like and anti-hormonal activity in road-affected soils. In studies focused on sediment contamination, the compounds with dioxin-like toxicity, anti/estrogenicity and anti/androgenicity were found in extracts of sediments from Czech surface waters. Their concentrations were similar to concentrations in other areas in Europe. The study investigating heavily polluted sediments from river Kymi in Finland showed good correlation of the results of in vitro yeast-based and mammalian cell-based assays and chemical analyses. In vitro bioassays also demonstrated seasonal and regional variability of pollution in dynamic river system, which has strong implications for monitoring strategies. A study investigating the influence of contamination of sediments on the occurrence of intersex in crustaceans in field documented sensitive indication of endocrine disruptive potencies by in vitro biotests, which was then reflected in effects in vivo. Last two papers in this thesis bring unique information on the presence of bioactive compounds in cyanobacteria, algae and complex cyanobacterial water blooms. The estrogenic potencies were found both for the intracellular and extracellular metabolites of cyanobacteria, which means that these compounds are produced to their surrounding environment. The detected levels in ng/L range could be of great environmental relevance, namely in case of mass development of cyanobacterial water blooms. The studies in this thesis demonstrated very good applicability of a set of specific in vitro reporter-gene bioassays for the evaluation of biological potencies of complex mixtures. They document that information from the specific bioassays complements the results of chemical analysis and enables better characterization of the presence of bioactive compounds in relation to potential adverse effects.

Keywords

in vitro bioassay, complex samples, sediment, soil, cyanobacteria, dioxin-like activity, anti/estrogenicity, anti/androgenicity, in vitro biotest, komplexní vzorky, půda, sinice, dioxinová aktivita, anti/estrogenita, anti/androgenita

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 8. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 25. 9. 2012
• Supervisor: doc. Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Pavel Čupr, Ph.D., prof. MVDr. Zdeňka Svobodová, DrSc., doc.Ing. Tomáš Randák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry