Vliv inhibice proteasomu na degradaci proteinů kančích spermií během in vitro kapacitace

Bc. Hana Vonšovská

Diplomová práce

Effect of proteasomal inhibition on boar sperm protein degradation during in vitro capacitation

Anotace:

Kapacitace spermií je klíčovým procesem pro úspěšné splynutí samčí a samičí pohlavní buňky. Během kapacitace prodělává spermie mnoho změn, přičemž jednou z nejdůležitějších je degradace proteinů navázaných na povrchu hlavičky spermie. Předpokládá se, že degradace proteinů na spermiích je zprostředkována ubiquitin-proteasomovým systémem. Nejprve je protein, který je určený k degradaci, označen polyubiquitinovým řetězcem, jenž je následně vystaven proteasomu, který polyubiquitinový řetězec deubiquitinuje a následně degraduje samotný protein. Cílem této práce bylo potvrdit, zda se na degradaci povrchových proteinů spermií podílí ubiquitin-proteasomový systém. Pro inhibici proteasomu byl využit inhibitor MG-132 rozpuštěný v DMSO. Inhibice proteasomu byla testována na základě imunodetekce mono-/poly-ubiquitinace v proteinových extraktech spermií před a po kapacitaci separovaných SDS elektroforesou a přenesených na nitrocelulosovou membránu. K vyhodnocení imunodetekce mono-/poly-ubiquitinovaných proteinů spermií byla použita denzitometrická analýza a byl pozorován statisticky významný rozdíl v mono-/poly-ubiquitinaci proteinů u spermií kapacitovaných v nemodifikovaném médiu a v mono-/poly-ubiquitinaci proteinů spermií kapacitovaných v modifikovaném médiu s inhibitorem MG-132 (p <0,05). Byla provedena imunolokalizace ubiquitinace na fixovaných kančích spermiích před a po in vitro kapacitaci. Spermie byly hodnoceny pod fluorescenčním a konfokálním mikroskopem a na základě denzitometrické analýzy byl pozorován rozdíl v intenzitě imunofluorescenčního signálu detekce ubiquitinace mezi spermiemi kapacitovanými v nemodifikovaném médiu a spermiemi kapacitovanými v médiu s přídavkem inhibitoru proteasomu MG-132. Ubiquitin-proteasomový systém se tedy s velkou pravděpodobností podílí na degradaci některých proteinů spermií během jejich in vitro kapacitace.

Abstract:

Sperm capacitation is the key process for a successful fusion of male sperm and female oocyte. During capacitation, sperm undergoes many changes, one of the most important being the degradation of proteins bound to the sperm head surface. Sperm degradation of proteins is believed to be mediated by the ubiquitin-proteasome system. First, the protein to be degraded is labelled with a polyubiquitin chain that is subsequently exposed to a proteasome that deubiquitinates the polyubiquitin chain and subsequently degrades the protein itself. The aim of this work is to confirm whether the ubiquitin-proteasome system is involved in degradation of sperm surface proteins. To inhibit proteasome, an MG-132 inhibitor dissolved in DMSO was used. Proteasome inhibition was tested by immunodetection of mono-/poly-ubiquitination in protein sperm extracts before and after capacitation separated by SDS electrophoresis and transferred to nitrocellulose membrane. Densitometric analysis was used to evaluate the immunodetection of mono-/poly-ubiquitinated sperm proteins, and a statistically significant difference was observed in mono-/poly-ubiquitination of spermatozoa proteins capacitated in unmodified medium and in mono-/poly-ubiquitination of spermatozoa proteins capacitated in the modified medium with MG-132 inhibitor (p <0.05). Immunolocalization of ubiquitination was performed on fixed boar sperm before and after in vitro capacitation. Sperms were evaluated under fluorescence and confocal microscopy and a difference in the intensity of immunofluorescence signal detection of ubiquitination between spermatozoa capacitated in unmodified medium and spermatozoa capacitated in medium with the addition of proteasome inhibitor MG-132 was observed based on densitometric analysis. The ubiquitin-proteasome system is likely to contribute to the degradation of sperm proteins during their in vitro capacitation.

Klíčová slova

spermie, kapacitace, proteasom, ubiquitin, inhibice

Keywords

sperm, capacitation, proteasom, ubiquitin, inhibition

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie