Optimalizace a validace stanovení standardních hodnot homocysteinu, methotrexátu a folátu v mozkomíšním moku u onkologicky nemocných dětí, jako biomarkeru terapeutického efektu a toxicity methotrexátu podávaného systémově a intrathekálně

Bc. Michal Řiháček

Master's thesis

Optimalization and validation of methotrexate, folate and homocysteine CSF levels determination in children with cancer as biomarkers of therapeutical effect and toxicity of systemic and intrathecal methotrexate

Abstract:

Methotrexát byl před 70 lety zaveden do klinické praxe díky své imunosupresivní a protinádorové aktivitě. Dnes zůstává zlatým standardem v terapii revmatoidní arthritidy a některých maligních onemocnění, přestože jsou na trhu modernější přípravky a biologická léčba. Methotrexát je dlouhodobě znám jako kompetitivní inhibitor enzymu dihydrofolátreduktasy, což je jeho hlavní mechanismus účinku. Blokádou dihydrofolátreduktasy dochází k významnému ovlivnění metabolismu folátu a homocysteinu, sloučenin účastnících se přenosu jednouhlíkatých fragmentů, který je nezbytný pro syntézu DNA. Endogenními metabolity methotrexátu jsou 7-hydroxymethotrexát, který vzniká jaterní biotransformací parentální sloučeniny, a intracelulárně syntetizované polyglutamátové formy. U maligních onemocnění postihujících centrální nervový systém je pro zajištění dostatečného terapeutického účinku methotrexát podáván intrathekálně lumbální punkcí. V rámci optimalizace terapeutických protokolů bývá diskutována nutnost tohoto podání. Farmakokinetická studie, zaměřená na přestup methotrexátu přes hematolikvorovou bariéru do mozkomíšního moku, vyžaduje znalost plazmatické i likvorové koncentrace, kterou nelze rutinně stanovit. Diplomová práce prezentuje postup při vývoji nové metody stanovení methotrexátu a jeho hlavního metabolitu 7-hydroxymethotrexátu v plazmě i mozkomíšním moku na bázi ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Chromatografické podmínky v systému modifikované normální fáze s alkalickým pH solventů zajišťují efektivní separaci a dostatečnou výtěžnost pro kvantifikaci nízkých likvorových koncentrací methotrexátu i 7-hydroxymethotrexátu s využitím aminopterinu jako vnitřního standardu. Detekce probíhá při vlnové délce 303 nm. Práce dále předkládá výsledky aplikace dostupných imunoanalytických metod na stanovení folátu a homocysteinu v CSF jako potenciálních biomarkerů neurotoxicity a terapeutického efektu systémového či intrathekálního methotrexátu.

Abstract:

Immunosupressive and antineoplastic activity brought methotrexate to its clinical use many years ago. Although modern antitumour and antiinflammatory drugs have challenged methotrexate, its use in rheumatoid arthritis and in some types of pediatric and adult malignancies remains a gold standard. Methotrexate main mechanism of action is competitive inhibition of dihydrofolatereductase that affects metabolism of folate and homocysteine involved in the transport of single carbon units. This pathway is essential for DNA synthesis. In vivo metabolism includes liver biotransformation of methotrexate to 7-hydroxymethotrexate and intracellular synthesis of methotrexate polyglutamates. Methotrexate is further used to treat neoplasms in central nervous system. Therapeutic concentrations in cerebrospinal fluid is achieved mostly by intrathecal administration. Necessity of this administration is steadily being discussed. Determination of methotrexate in cerebrospinal fluid is needed for pharmacokinetic study of its blood brain barrier transport. This diploma thesis presents development of ultra-high performance chromatographic method for determination of methotrexate and its major metabolite 7-hydroxymethotrexate in cerebrospinal fluid. Optimized chromatographic conditions include modified normal phase system with alkaline pH of the solvents for effective separation and recovery to quantitate even low concentrations of both methotrexate and 7-hydroxymethotrexate in cerebrospinal fluid using aminopterin as internal standard. Ultraviolet detection was set to 303 nm. Furthermore, immunoassays of possible biomarkers of methotrexate neurotoxicity and therapeutic effect, folate and homocysteine, are included in this thesis.

Keywords

methotrexát, kyselina listová, homocystein, chemoterapie, toxicita, chromatografie, methotrexate, folic acid, homocysteine, chemotherapy, toxicity, chromatography

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2014
• Supervisor: doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry