Vývoj LC-MS metody pro stanovení biogenních aminů v tkáních včely medonosné

Bc. Jakub ROZHON

Diplomová práce

Development of LC-MS techniques for biogenic amines detection in honeybee´s tissues

Anotace:

Celosvětově dochází ke znatelnému snižování populací včely medonosné (Apis mellifera), což je velký problém z hlediska zachování stability rostlinného a živočišného ekosystému a pěstování zemědělských plodin. Bazické biogenní aminy (BAs) dopamin, oktopamin a histamin zprostředkovávají jako neuromodulátory a neurotransmitery řadu biochemických procesů spojených s vnímáním jedince a jeho reakcemi na stresové podmínky, což se projevuje odlišnými reakcemi na základě jeho biologických potřeb. Reakcemi jedince na okolní vjemy jsou ovlivněny intenzita jeho pohybu, preference teploty a s ní spojený vývoj jedince, sociální interakce v rámci společenství sociálního hmyzu a chování spojené s krmením a obrannou, či imunitní reakcí jedince. Tato práce je věnována tvorbě metody pro extrakci, separaci a kvantifikaci dopaminu, oktopaminu a histaminu z vybraných částí těla včely medonosné. Výstupem experimentální části práce je optimalizovaný protokol zpracování různých tkání včely medonosné založený na extrakci vzorků hlavy, trávicího traktu, jedové žlázy a jedu v 90% acetonitrilu s 0,01% kyselinou mravenčí, na který navazuje derivatizace pomocí benzoylchloridu a analýza založená na metodě vysokoúčinné kapalinové chromatografie v reverzní fázi kombinované s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC MS/MS). Uvedeným způsobem byly kvantifikovány BAs dopamin, oktopamin a histamin v hlavě a trávicím traktu včel z včelstev infestovaných kleštíkem včelím (Varroa destructor), nebo ošetřených herbicidem paraquat (PQ). Dále byly uvedené BAs kvantifikovány v jedové žláze, či jedu zdravých včel. Látková množství BAs byla postupně určena v jedné hlavě, nebo trávicím traktu včel trpících varoózou na 1,17 ? 0,52 nmol a 4,57 ? 0,38 nmol (dopamin), 27,22 ? 0,29 nmol (oktopamin, pouze trávicí trakt), poté 2,69 ? 0,14 nmol a 114,47 ? 8,63 nmol (histamin). V jedné hlavě, či trávicím traktu včel ošetřených PQ (per os) bylo stanoveno látkové množství vybraných BAs na 0,07 ? 0,04 nmol (dopamin, pouze trávicí trakt), dále 1,06 ? 0,21 nmol a 2,85 ? 0,66 nmol (histamin). V jedné jedové žláze zdravých včel, nebo v 1 g jejich lyofilizovaného jedu o různých koncentracích bylo naměřeno 8,74 ? 4,22 nmol a 24,05 ? 3,56 nmol.g-1 dopaminu, poté 21,33 ? 3,55 nmol a 158,67 ? 7,60 nmol.g-1 histaminu. Látková množství dopaminu ve vzorcích hlavy včel ošetřených PQ nebyla na měřitelné hladině. Optimalizovaná metoda je funkční pro stanovení dopaminu a histaminu. Detekce oktopaminu je problematická a bude nejspíše potřeba provést další optimalizační kroky chromatografické separace či hmotnostně spektrometrické analýzy. Takto upravená metoda přispěje po její validaci a uvedení do laboratorní praxe k výzkumu obranných reakcí včel či dalšího hmyzu.

Abstract:

The worldwide number of honeybee´s (Apis mellifera) populations is noticeably decreasing, which creates a big problem in case of plant and animal ecosystem stability and agricultural crops cultivation. Basic biogenic amines (BAs) dopamine, octopamine and histamine act in ivertebrates as neuromodulators and neurotransmitters - they mediate a number of biochemical pathways connected with senses of invertebrates and their reactions to stress conditions which are displayed in different reactions in favour of individuals biological needs. Individual´s reactions to external stimuli affect its intensity of locomotory activity, temperature preference connected with its body evolution, social interactions in case of social insect and behaviour connected with individual´s feeding, defensive, or immune reaction. The aim of this thesis is to create methods for extraction, separation and quantification of dopamine, octopamine and histamine from different honeybee´s body parts. Thesis experimental part contains optimised protocol of processing different honeybee´s body parts based on head, digestive tract, venomous gland and venom extraction in 90% acetonitrile with addition of 0,01% formic acid, which is followed by derivatisation via benzyolchloride and analysis based on high performance liquid chromatography in reverse phase combined with tandem mass spectrometry (HPLC MS/MS). Thereby were quantified BAs dopamine, octopamine and histamine in head and digestive tract of honeybees infested with Varroa destructor parasite or treated with paraquat (PQ) herbicide. Listed BAs were further quantified in venomous gland or venom from healthy bees. BAs amounts were determined in one head or digestive tract of bees suffering from varroosis to 1,17 ? 0,52 nmol and 4,57 ? 0,38 nmol (dopamine), 27,22 ? 0,29 nmol (octopamine, digestive tract only), then 2,69 ? 0,14 nmol and 114,47 ? 8,63 nmol (histamine). In one head or digestive tract of bees treated with PQ (per os) the amount of BAs was set to 0,07 ? 0,04 nmol (dopamine, digestive tract only), then 1,06 ? 0,21 nmol and 2,85 ? 0,66 nmol (histamine). In one venomous gland or in 1 g of freeze dried venom (different concentrations) of healthy honeybees it was determined 8,74 ? 4,22 nmol and 24,05 ? 3,56 nmol.g-1 of dopamine, then 821,33 ? 3,55 nmol and 158,67 ? 7,60 nmol.g-1 of histamine. Dopamine amount in samples of bees treated with PQ was under the measurable level. The optimised method works for dopamine and histamine determination. Detection of octopamine is problematic and so it is essential to perform next optimisation steps of chromatographic separation and mass spectrometric analysis. Thereby optimised method will after its validation and introduction to laboratory practise contribute to research on defensive reactions of honeybees or other insect.

Klíčová slova

Včela medonosná, LC MS, biogenní aminy, dopamin, oktopamin, histamin, optimalizace, extrakce, separace, kvantifikace.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 24. 4. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie