Příprava fluorescenčně značených fágů pro mikroskopickou analýzu eradikace biofilmu

Bc. Anna Sobotková

Diplomová práce

Preparation of fluorescently labeled phages for microscopic analysis of biofilm eradication

Anotace:

Bakterie rezistentní vůči antibiotikům představují zdravotní riziko a zapříčiňují také komplikace v průmyslu. Bakterie mohou vytvořit multicelulární strukturu nazývanou biofilm. Buňky zanořené v biofilmu jsou více rezistentní vůči stresu a antibiotikům než buňky planktonní, proto je biofilm těžké rozrušit. Slibným přístupem, jak biofilm eradikovat, je použití bakteriofágů. Mechanismus, jak se fágy šíří v biofilmu, není zcela pochopen, neboť chybí vhodné vizualizační metody. Proto se v této práci zaměřujeme na několik způsobů, jak vizualizovat fágovou infekci v biofilmu pomocí fluorescenční mikroskopie. Teoretická část pojednává o zdravotních a ekonomických dopadech biofilmu a jak je možné je řešit, ale také popisuje strategie pro editaci fágového genomu. Dále jsou teoreticky popsány aplikace fágů a systému CRISPR-Cas v biotechnologiích. V praktické části jsou zahrnuty strategie pro vizualizaci fágové infekce v biofilmu zlatého stafylokoka. První strategie využívá CRISPR-Cas jakožto výkonný biotechnologický nástroj k úpravě fágových genomů vložením sekvence fluorescenčního proteinu. Druhá strategie je založená na expresi fluorescenčního proteinu z hostitelských buněk, které obsahují plazmid, na němž nesou fluorescenční protein pod kontrolou specifického fágového promotoru.

Abstract:

Antibiotic-resistant bacteria are a health threat and cause complications in industry. Bacteria can form a multicellular structure called biofilm. Cells embedded in a biofilm become more resistant to environmental stress as well as antibiotics than planktonic cells, hence biofilm is difficult to eradicate. A promising approach to eradicate biofilm is the use of bacteriophages. The mechanism of phage propagation through biofilm is not well understood because of the lack of suitable visualization methods. Therefore, in this thesis, we focus on various approaches to visualization of phage propagation through biofilm using fluorescence microscopy. The theoretical part describes the health and economic impacts of biofilm and how they can be solved, and strategies for phage genome modification. Applications of phages and CRISPR-Cas in biotechnology are also described in the theoretical part. The practical part includes strategies to visualize phage infection in an S. aureus biofilm. The first strategy utilizes CRISPR-Cas as a powerful biotechnological tool to modify phage genomes by insertion of fluorescent protein coding sequence. The second strategy is based on fluorescent protein expression from host cells containing a plasmid with a phage-specific promoter controlling fluorescent protein expression.

Keywords

CRISPR-Cas, fág, bakteriofág, biotechnologie, biofilm, phage, bacteriophage, biotechnology

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 5. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2022
• Vedoucí: doc. Mgr. Pavel Plevka, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Martin Benešík, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Biotechnologie