New approaches in platinum-based therapy of solid tumors

Mgr. Olga Vondálová Blanářová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Platinové komplexy patří mezi nejčastěji používané chemoterapeutické látky v léčbě nádorů. Jejich použití v terapii je ale často provázeno závažnými nežádoucími účinky a výskytem vnitřní nebo získané rezistance nádorových buněk. S cílem předejít těmto komplikacím jsou proto vyvíjeny a testovány nové preparáty různých struktur a vlastností. Jedním z takových komplexů je nový platinový derivát. komerčně označovaný LA-12, s atomem platiny v oxidačním čísle (IV), který se zdá být slibným kandidátem pro protinádorovou terapii. Kromě toho, že byla prokázána jeho vysoká účinnost in vitro, ale také in vivo, nevykazuje LA-12 zkříženou rezistenci s cisplatinou. V této práci jsme se proto zaměřili na rozšíření poznatků o molekulárních mechanismech účinků komplexu LA-12 především u nádorových buněk kolonu a prostaty. V první fázi jsme srovnávali cytostatické a cytotoxické účinky LA-12 s oxaliplatinou, která se běžně využívá v terapii nádorů kolorekta. Zjistili jsme, že LA-12 inhibuje proliferaci a indukuje apoptózu in vitro u nádorových buněk kolorekta ve dvacetkrát nižší koncentraci než oxaliplatina. Cytotoxický účinek LA-12 přitom nebyl závislý na přítomnosti proteinu p53 nebo p21, zatímco buňky bez proteinu p53 nebo p21 byly méně citlivé k působení oxaliplatiny. Dále byla pozornost zaměřena na analýzu buněčného cyklu s důrazem na postižení rozdílů v mechanismech působení LA-12 a oxaliplatiny. Ukázali jsme, že oxaliplatina vedla k výrazné zástavě buněčného cyklu v G1 a G2 fázi provázené poklesem počtu buněk, které replikují DNA, a poklesem počtu mitotických buněk. Naopak LA-12 způsobila pouze mírnou akumulaci buněk v G2 fázi, a dokonce i po 48 hodinách inkubace s LA-12 bylo pozorováno významné zastoupení cyklujících buněk, přestože buňky v populaci již masivně umíraly. To naznačuje, že oxaliplatina zástavami buněčného cyklu „poskytla buňkám více času“ na opravu poškozené DNA, zatímco po působení LA-12 mohlo více buněk procházet buněčným cyklem a nakonec umřely apoptózou. Platinové komplexy mohou být použity v kombinaci s jinými chemoterapeutickými látkami. V poslední době byly také testovány jako zcitlivující látky pro terapii léčivy specificky modulujícími apoptotické signální dráhy. TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) působí jako ligand receptorů smrti (death receptors, DRs). Jeho výhodou je preferenční aktivace apoptózy u nádorových buněk. Mnoho nádorů je ale bohužel k působení TRAILu rezistentních. Z toho důvodu se TRAIL kombinuje s různými látkami, které dokáží nádorové buňky k jeho působení zcitlivět. My jsme ukázali, že LA-12 a cisplatina podané v subtoxické koncentraci zcitlivují nádorové buňky kolonu HCT116 a prostaty PC-3 k apoptóze indukované TRAILem. Popsali jsme, že LA-12 a cisplatina zvýšily expresi DR5 na povrchu buněk a podpořily akumulaci receptorů smrti v lipidových raftech a zrychlení internalizace TRAILu. Prokázali jsme rovněž, že ke zcitlivění přispěla zvýšená exprese receptoru DR5, indukovaná působením obou platinových komplexů. Tyto výsledky ukazují, že LA-12 zabíjí nádorové buňky účinněji než oxaliplatina a cisplatina, přispívají k pochopení mechanismů účinků platinových chemoterapeutik a zdůrazňují úlohu membránových mikrodomén v těchto procesech. Zjištění, že LA-12 a cisplatina posilují TRAILem indukovanou apoptózu, by mohlo být základem nové kombinované protinádorové terapie.

Abstract:

Platinum compounds belong to the most commonly used drugs in the therapy of solid tumors. Their application is often hampered by incidence of severe side effects and inherent or acquired cancer cell resistance. To forewent these drawbacks, numerous platinum complexes of various structures and characteristics have been synthesized and tested to find desired properties. Among them, a platinum(IV) complex, commercially named LA-12, is a promising candidate for anticancer therapy, because it expressed efficacy in elimination of cancer cells of various origin in vitro but also in vivo and showed no cross-resistance with cisplatin. Therefore, we focused this work on elucidation of the molecular mechanisms of action of LA-12 in colon and prostate cancer cell lines. Initially, we compared cytostatic and cytotoxic effects of LA-12 with oxaliplatin, widely used drug in treatment of colorectal cancer. We found LA-12 to inhibit proliferation and induce apoptosis in vitro in colon cancer cells HCT116 in 20-fold lower concentration than oxaliplatin. Moreover, LA-12 was similarly toxic in colon cell lines independently on their p53 or p21 status, whereas loss of p53 or p21 protein conferred resistance to oxaliplatin. Next, we focused on modulation of the cell cycle with emphasis on different mechanisms underlying the action of LA-12 and oxaliplatin. We found oxaliplatin to be a potent inductor of cell cycle arrest in G1 and G2 phase, and inhibitor of DNA replication as well as mitotic entry. In contrast, LA-12 treatment led to only mild accumulation of cells in G2 phase and even after 48 h, there was a substantial portion of actively cycling cells, though by this time, cells were massively dying. It suggests that by halting the cell cycle, oxaliplatin provided more time to repair the damage, whereas after LA-12, more cells kept cycling and finally died by apoptosis. Platinum complexes can be used in combination with other conventional anticancer drugs. In recent years, they have been proposed to serve as sensitizers for apoptotic pathway-specific compounds. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a ligand of death receptors (DRs) and its main advantage is an induction of apoptosis preferentially in cancer cells. Unfortunately, many cancer cells are inherently TRAIL-resistant. For this reason, combinations of various drugs with TRAIL are suggested to sensitize cancer cells to TRAIL. We demonstrated that subtoxic doses of LA-12 or cisplatin enhanced TRAIL-induced apoptosis in colon HCT116 and prostate PC-3 cancer cells. Both platinum complexes induced expression of DR5 at cellular surface and mediated accumulation of DRs in lipid rafts and acceleration of TRAIL internalization. DR5 was identified as an important factor essential for the cooperative action of platinum drugs and TRAIL. Taken together, these data demonstrated higher efficiency of LA-12 over oxaliplatin and cisplatin, contributed to our understanding of mechanisms of action of platinum complexes and highlighted the role of lipid microdomains in these processes. Detection of cooperative effects of LA-12 and cisplatin with TRAIL may provide the rationale for future combination therapy.

Keywords

platinové komplexy, LA-12, buněčný cyklus, apoptóza, TRAIL platinum complexes, cell cycle, apoptosis, TRAIL

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 9. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 19. 9. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
• Reader: doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D., prof. MUDr. RNDr. Miroslav Červinka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology