Use of photoautotrophic cultures for high throughput screening of toxic compounds by fluorescence imaging

Mgr. et Mgr. Anna Segečová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Vzrůstající znečištění, používání herbicidů a rozmach rostlinných fenotypizačních technik zvyšuje poptávku po metodách schopných zachytit toxický stres v jeho počátcích například za účelem skríningu rostlinných odrůd náchylných či naopak odolných vůči danému toxikantu. Standardní testy toxicity pro rostliny založené na inhibici růstu jsou však pracné a mají relativně vysoké nároky na prostor, materiál a čas. Cílem této práce bylo sestavit detekční systém složený z komplementárních senzorů na bázi zobrazovací fluorometrie pro účely vysokokapacitního skríningu raných projevů toxického stresu. Za účelem redukce časových a prostorových nároků testů prováděných na celých rostlinách byl navržený systém testován i na fotoautotrofních (PA) buněčných suspenzích. Jako biomarkery toxického stresu byly sledovány změny ve vícebarevné fluorescenci a indukci fluorescence chlorofylu. Tyto metody detekovaly stres neinvazivně a dříve než se projevil inhibicí růstu, zachytily také mírné a dočasné změny a tím prokázaly dostatečnou citlivost pro využití ve skríningu toxicity. Pro tři toxikanty s rozdílným způsobem účinku bylo možné z měřených parametrů sestavit charakteristické otisky jejich stresové odezvy. Dále se potvrdilo, že PA buněčná suspenze reaguje na zkoumané toxikanty ve srovnání s celými rostlinami dříve a již na nižší koncentrace, je kompatibilní stestováním v mikrodestičkách a tudíž i vhodná pro vysokokapacitní preskríning toxicity. PA buněčné suspense byly využity a přinesly zajímavé a relevantní výsledky i v oblastech mimo toxikologii, avšak, jedním z důvodů, proč se nevyužívají víc, jsou jejich speciální kultivační nároky. V tradičním kultivačním postupu je potřebná koncentrace CO2 zajišťována karbonát- bikarbonátovým pufrem. Tento systém však jednak sestává ze složité skleněné sady, která není komerčně dostupná a také, jak bylo zjištěno naší studií, nezajišťuje dostatečnou stabilitu a úroveň CO2 po celou dobu kultivačního cyklu. Proto bylo provedeno několik vylepšení. Jako alternativu k tradičnímu kultivačnímu systému malých objemů byla zavedena kultivace ve fotoinkubátoru s možností regulace ambientní koncentrace CO2. Růst a charakteristiky biomasy PA buněčných suspenzí v tomto kultivačním systému jsou srovnatelné s tradičním systémem, rychlost akumulace biomasy je navíc stabilnější po celou dobu kultivačního cyklu. Druhým vylepšením je zavedení kultivace v maloobjemovém fotobioreaktoru. Tento systém umožňuje oproti tomu tradičnímu kultivaci ve větším objemu, sledovat různé parametry aměnit nastavení v reálném čase i na dálku a používat dynamické kultivační protokoly. Výsledky optimalizace růstu PA buněčné suspenze ve fotobioreaktoru byly uspokojivé, i když vlastnosti biomasy nedosáhly kvality biomasy kultivované tradičním způsobem. Uvedeny jsou možné příčiny i návrhy pro další možnosti optimalizace. Tyto nově zavedené kultivační systémy zajišťují stabilní a nastavitelné kultivační podmínky. Umožňují tak plnou kontrolu těchto faktorů při experimentech a rozšiřují i možnosti využití PA buněčných kultur. V neposlední řadě, všechny potřebné komponenty a přístroje jsou komerčně dostupné, což nejen dělá kultivaci PA buněčných suspenzí dostupnější, ale přispívá i ke standardizaci experimentálních postupů, které PA buněčné suspenze využívaji

Abstract:

With increasing pollution, herbicide application and interest in plant phenotyping, sensors capturing early responses to toxic stress are required for screening of susceptible or resistant plant varieties. However, standard toxicity tests on plants are laborious, demanding in terms of space and material and measurement of growth-inhibition-based endpoints requires a relatively long time. The aim of this study was to establish a multi-sensor system based on fluorescence imaging for high-throughput screening of early toxic stress. In order to minimize the duration and space requirements of plant toxicity screening tests, the potential of photoautotrophic (PA) cell suspensions for such setup was tested. As biomarkers of toxic stress, parameters and ratios of multicolor fluorescence and chlorophyll fluorescence induction were measured. The selected methods proved to be suitable candidates for toxicity screening as the stress was detected non-invasively, earlier than inhibition of plant growth and they also allowed detection of mild and transient stress responses. Based on the measured parameters, it was possible to construct stress signatures specific for three toxic compounds with different modes of action. The study also confirmed that the PA cell suspension reacts to tested toxicants faster and in lower concentrations than whole plants, that it is compatible with testing in microplates and thus could be useful for rapid high-throughput pre-screening of toxic stress. Earlier studies on the subject have established that PA cell suspensions can be used for obtaining interesting and relevant data also in fields other than toxicology. Nevertheless, one of the reasons the use of PA cell suspensions is not more widespread is the necessity of special cultivation settings. The traditional cultivation setup based on a batch carbonate-bicarbonate buffer system providing the desired CO2 concentration for the culture consists of a rather elaborate structure of custom-made glass vessels. Moreover, as our study indicates, the provided CO2 concentration is not stable. Therefore, improvements in the cultivation setup were made. A small-scale cultivation setup alternative to the conventional one was established in a photoincubator with adjustable ambient CO2 level. The growth and biomass characteristics of the PA cell suspensions in this setup were comparable with the conventional one and the biomass accumulation rate was even more stable throughout the cultivation period.The second improvement to the cultivation setup consists in employment of a laboratory scale photobioreactor. This setup provides a semi-upscale, online monitoring of relevant cultivation parameters and settings and allows for employment of dynamic cultivation protocols. Optimization of growth of PA cell suspension in a photobioreactor gave satisfactory results, although the biomass characteristics did not reach those of the conventional setup. Probable causes of such insufficiency as well as possibilities for further improvement were listed. The innovated cultivation setups provide stability and adjustability of cultivation conditions, ensuring full control of such factors for experimental use and broaden the range of possible applications of PA cell suspensions. On top of that, all components and devices are commercially available, thus making not only the cultivation of PA cell suspensions available but also contributing to standardization of research employing PA cell suspensions.

Keywords

abiotic stress, chlorophyll fluorescence induction, chromium, cultivation, DCMU, Fv/Fm, glyphosate, herbicide, multicolor fluorescence, principal component analysis, phenotyping, photobioreactor, abiotický stres, chrom, fenotypizace, indukce fluorescence chlorofylu, fotobioreaktor, glyfosát, herbicid, kultivace, analýza hlavních komponent, vícebarevná fluorescence

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 11. 2. 2020
• Supervisor: prof. Dr. Thomas Roitsch
• Reader: Tristan Boureau, Associate Professor, Stephen Rolfe, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Ecotoxicology