Taxonomie grampozitivních koků a typizace vybraných skupin

Mgr. Dana Nováková, Ph.D.

Disertační práce

Taxonomy of grampositive cocci and typing of selected taxa

Anotace:

Předkládaná disertační práce se zabývá identifikací a typizací novobiocin rezistentních stafylokoků. Tyto stafylokoky náleží do skupiny koaguláza negativních druhů. Jsou převážně nepatogenní či podmíněně patogenní, proto se jim v klinické mikrobiologii nepřikládá velký význam. Běžně se vyskytují na kůži a sliznici savců a ptáků a některé druhy jsou významné také pro jejich využití v potravinářském průmyslu. Kmeny stafylokoků pocházející z klinického humánního a veterinárního materiálu, ze živočišných vzorků, živočišných produktů a z prostředí (celkem 82 kmenů) byly testovány na základě biochemických vlastností a pomocí molekulárně-biologických metod. Biotypizace byla provedena pomocí komerčních souprav (API Staph, ID32 Staph, STAPHYtest 16 a API ZYM) a konvenčních biochemických testů. Pro zjištění vnitrodruhového a mezidruhového polymorfismu testovaných kmenů byla zvolena ribotypizace za použití EcoRI a HindIII restrikčních endonukleáz a značené sondy komplementární k 16S a 23S rRNA. Kmeny byly dále charakterizovány analýzou celkových buněčných proteinů provedenou elektroforézou v polyakrylamidovém gelu za denaturačních podmínek (SDS-PAGE). Výsledky vybraných kmenů získané výše uvedenými metodami byly ověřeny sekvencováním genu pro 16S rRNA a druhově specifickými PCR metodami. Vybrané kmeny byly typizovány pulzní gelovou elektroforézou (PFGE) SmaI makrorestikčních fragmentů. Výsledky biotypizace byly v rozporu s výsledky molekulárně-biologických metod. Zatímco na základě fenotypových projevů bylo chybně identifikováno více než 60% kmenů, genotypizační metody a analýza proteinových profilů identifikovaly 37 kmenů S. equorum, 9 S. succinus, 5 S. nepalensis a 31 kmenů S. xylosus. Výsledky těchto metod byly ve vzájemné shodě a na jejich základě byly identifikovány i biochemicky zcela atypické kmeny. Makrorestrikční analýza se osvědčila pro typizaci kmenů S. nepalensis a vybrané druhově specifické PCR pro rychlou orientační identifikaci testovaných kmenů. Ribotypizace a analýza buněčných proteinů umožnila také vnitrodruhové rozlišení kmenů. Profily proteinů i ribotypů vykazovaly poměrně velkou heterogenitu. U kmenů izolovaných z klinických vzorků, živočišných produktů a z prostředí nebyla prokázána souvislost mezi těmito profily a zdroji izolace. Velká podobnost ribotypů kmenů S. equorum izolovaných z kůže lam a netopýrů naznačuje, že tyto bakterie mohou představovat ekovary osidlující kůži uvedených zvířat. Z výsledků této práce vyplývá, že pro spolehlivou identifikaci novobiocin rezistentních stafylokoků je potřeba výsledky biotypizace doplnit některou z vhodných molekulárně-biologických metod. V disertační práci byly prokázány vůbec první klinické izoláty S. succinus a S. nepalensis, což naznačuje zvyšující se význam novobiocin rezistentních stafylokoků v klinické humánní mikrobiologii.

Abstract:

The present dissertation thesis is focussed on identification and typing of novobiocin-resistant staphylococci. These staphylococci are coagulase-negative species, which are common inhabitants of skin and mucous membranes of mammals and birds. They were generally considered as low-pathogenic or occasional pathogens in past. Some of them are successfully used in the food industry. Strains isolated from human and veterinary clinical material, animals, diary products and environmental specimens were tested based on biochemical properties and using molecular biological methods. Biotyping was done by commercial kits (API Staph, ID32 Staph, STAPHYtest 16 and API ZYM) and conventional biochemical tests. Ribotyping done using EcoRI and HindIII restriction endonucleases and digoxigenin-labelled probe complementary to 16S and 23S rRNA was used for determination of intraspecies and interspecies differentiation. Further characterization of the tested strains was done by whole-cell protein analysis performed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Results were verified by 16S rRNA gene sequencing and species specific PCRs in selected strains. Pulse field gel electrophoresis (PFGE) of SmaI macrorestriction fragments was used for typing of the selected tested strains. The results of the biotyping were in contradiction with those of the molecular biological methods. While more than 60% of the strains were identified incorrectly based on the phenotyping, genotyping as well as protein profiles analysis assigned 37 S. equorum, 9 S. succinus, 5 S. nepalensis and 31 S. xylosus strains. The results of these methods were in concordance to each other and allowed identification of all tested strains including the biochemically atypical strains. The analysis of macrorestriction profiles proved to be good tool for S. nepalensis strain typing and selected species specific PCRs for fast screening of tested strains. The ribotyping and whole-cell protein analysis provided also intraspecies differentiation. Relatively high heterogeneity of the ribotypes as well as the protein profiles was observed in all tested species. No correlation between these profiles and the sources of isolation was proved in the clinical isolates, strains from diary products and environmental samples. Nevertheless, high similarity of the ribotypes obtained from S. equorum strains isolated from llamas and bats imply that this species may represent ecovars in these environments. The results indicate that phenotypic identification should be necessarily confirmed by some of the suitable molecular biological methods in novobiocin-resistant staphylococci. The present study describes the very first S. succinus and S. nepalensis clinical isolates. This finding implies an increasing importance of novobiocin-resistant staphylococci in human clinical microbiology.

Klíčová slova

S. xylosus, S. equorum, S. succinus, S. nepalensis, novobiocin rezistentní stafylokoky, ribotypizace, analýza celkových buněčných proteinů, 16S rRNA sekvencování, PFGE, novobiocin resistant staphylococci, ribotyping, whole-cell protein analysis, 16S rRNA sequencing

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 12. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 12. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Mikrobiologie