Funkční genomika modelových rostlin rodu Silene

Ing. Vojtěch Hudzieczek, Ph.D.

Doctoral thesis

Functional genomics of model plants in the genus Silene

Abstract:

Rostliny rodu Silene jsou klasickými modelovými organismy, které svého času používali k řešení biologických otázek také Charles Darwin nebo Johann Gregor Mendel. Druhy rodu Silene jsou používány ke studiu různorodých biologických témat jako je např. evoluce dvoudomosti a pohlavních chromozomů, pohlavní dimorfismus, epigenetická regulace transponovatelných elementů, sexuálně přenosné choroby, biologie invazivních druhů či tolerance k těžkým kovům apod. V poslední době došlo výraznému rozvoji v oblasti masivního paralelního sekvenování a byly identifikovány stovky genů s potenciálním významem ve zmíněných biologických fenoménech. Dosud ovšem nebyly vytvořeny nástroje pro studium funkce genů u těchto organismů a není proto možné výsledky sekvenačních analýz ověřit. V této práci jsme zaměřili na použití metod reverzní genetiky u modelové rostliny Silene latifolia. Pro tento účel byl vypracován protokol pro in vitro regeneraci a transformaci S. latifolia pomocí patogenní bakterie Agrobacterium rhizogenes. Transgeny vnesené do rostlin S. latifolia vykazovaly stabilní expresi a mendelistickou dědičnost. Z důvodu časové náročnosti vyvinutého protokolu byly vytvořeny metody pro tranzientní expresi genů a rychlé stanovení aktivity programovatelných nukleáz v protoplastech a kořenových kulturách S. latifolia. Transformační protokol byl úspěšně použit pro ověření možnosti umlčení genů pomocí RNA interference a také pro editaci genomu pomocí CRISPR/Cas9 nukleáz. Získané výsledky a metodické přístupy také umožní vědecké komunitě studovat úlohu kandidátních genů v zajímavých biologických fenoménech u S. latifolia.

Abstract:

Genus Silene comprises several classical model organisms, which have been used to address biological questions by Charles Darwin and Johann Gregor Mendel. Species from the genus Silene are employed to study various biological topics such as evolution of dioecy and sex chromosomes, sexual dimorfism, epigenetic regulation of transposable elements, sexually transmitted diseases, invasive species biology, heavy metal tolerance etc. Recent progress in massive parallel sequencing technologies facilitated identification of hundreds of genes potentially involved in aforementioned biological phenomenon. However, the tools for studying gene functions in Silene species are missing and it is not possible to validate the sequencing analyses. In this study, we have focused on application of reverse genetics on model plant Silene latifolia. For this reason, we have developed a protocol for in vitro regeneration and Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of S. latifolia. Transgenes integrated into S. latifolia genome showed stable expression and Mendelian inheritance. Because transformation protocol requires a substantial amount of time, the methods for transient gene expression and rapid assessment of site-specific nucleases activity in S. latifolia protoplasts and hairy root cultures were developed. Transformation protocol was successfully used to demonstrate the possibility of gene silencing and genome editing by CRISPR/Cas9 nucleases. These results and methodical approaches can afford opportunity to study the function of candidate genes involved in interesting biological phenomena in S. latifolia.

Keywords

Silene, plant transgenosis, Agrobacterium rhizogenes, in vitro regeneration, tissue cultures, targeted gene disruption, amiRNA, CRISPR/Cas9, genome editing, protoplasts, transgenoze rostlin, regenerace in vitro, tkáňové kultury, cílená mutageneze, editace genomu, protoplasty

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 27. 6. 2018
• Supervisor: RNDr. Roman Hobza, Ph.D.
• Reader: prof. RNDr. Zdeněk Opatrný, CSc., Mgr. Jan Bartoš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics