Stabilizace PCR reagencií pro skladování při pokojové teplotě

Bc. Hana CRLÍKOVÁ

Master's thesis

Stabilisation of PCR reagents for storing at room temperature

Abstract:

PCR analýza patří mezi jednu z nejčastěji využívaných metod molekulární biologie, avšak i tato metoda má určité limitace. Všechny používané reagencie musí být skladovány v mrazničce a mají jen omezený počet rozmrazení. DNA je konvenčně skladována v mrazničce jako reagencie používané při PCR reakci. Dnes ke standardnímu skladování existují i alternativní možnosti skladování DNA při pokojové teplotě ve formě FTA karty či ve formě vysušeného prášku (vysoušení DNA pomocí lyofilizace, sprejování za pokojové či snížené teploty). K alternativnímu způsobu skladování jak DNA, tak i reagencií používaných při PCR je možno použít tři sacharidy - trehalózu, pullulan a xanthan, u kterých byly prokázány protektivní účinky na proteiny či DNA skladovaných při pokojové teplotě. V experimentální části byly prováděny testy inhibice. Na základě výsledků byly vybrány roztoky sacharidů pro testování stability. Během testování stability bylo zjištěno, že roztoky sacharidů nevykazují protektivní účinky vůči Taq polymeráze, proto byla k vysušené směsi dodána spolu s vodou při rehydrataci směsi. Testy stability probíhaly po dobu 16 týdnů. Bylo zjištěno, že nejlepší protektivní účinky vykazoval 0,8% roztok xanthanu a naopak nejhorší protektivní účinek vykazuje 4% roztok pullulanu, u kterého bylo již v týdnu 10 zaznamenáno zpoždění signálu natolik výrazné, že se dostalo mimo detekční rozsah PCR protokolu.

Abstract:

The PCR analysis is one of the most used metods in molecular biology in spite its certain limitations. All reagents used during an analysis must be stored in a freezer and freeze-thaw cycles are limited. While DNA is usually stored in a refrigerator alongside reagents, there nowadays exist alternative room temperature storage metods such as FTA cards or dried DNA powder (prepared by lyophlisation, spray-drying, spray-freeze drying). Three saccharides trehalose, xanthan and pullulan - can be used for alternative room temperature storage of DNA and reagents used in PCR analysis. Inhibition testing was performed in the experimental part of the thesis. Saccharide solutions were chosen for stability testing based on the results obtained during inhibition testing. It was discovered that no saccharide solution had a protective effect towards Taq polymerase. Due to this fact, Taq polymerase was added to dried mixture with water during rehydratation. Stability testing took 16 weeks and it was discovered that the best protective effect is achieved by 0.8% solution of xanthan, while the worst protective effect is produced by using 4% solution of pullulan, which by week 10 showed that the delay of signal has grown significantly, even beyond the scale of PCR protocol.

Keywords

trehalóza, xanthan, pullulan, stabilizace, testy stability, testy inhibice, real-time PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 7. 2016

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology