In-cell NMR spectroscopy of nucleic acids in human cells

Mgr. Šimon Džatko, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Struktura nukleových kyselin reaguje na mnoho nespecifických faktorů jako jsou iontová síla, typ iontů, pH, tlačenkový efekt nebo vazební partneři. Všechny tyto faktory ovlivňují nukleové kyseliny in vivo. Současné biofyzikální metody pro studium nukleových kyselin v zjednodušených in vitro podmínkách jsou inherentně zatížené subjektivním výběrem experimentálních podmínek, tudíž obdržené vlastnosti nemusí být automaticky přenositelné na chování studovaných molekul také in vivo. Tato disertační práce popisuje aplikaci nového přístupu založeného na in-cell NMR spektroskopii jako efektivní metody pro studium struktury a interakcí nukleových kyselin přímo v komplexním prostředí živých buněk. Práce ukazuje schopnost in-cell NMR spektroskopie semikvantitativně vyhodnotit stabilitu struktury DNA v živých lidských buňkách. Dále tato práce popisuje postup pro charakterizaci DNA-ligand interakce ve vnitrobuněčném prostředí a navrhuje možnosti jeho využití při vývoji léčiv. Práce rovněž ukazuje využítí naší metody pro studium stability RNA s nemodifikovanou páteří v živých buňkách, jakožto i její využití pro charakterizaci RNA-ligand interakce.

Abstract:

The structure of nucleic acids is responsive to many nonspecific factors such as ionic strength and type, pH, molecular crowding and binding partners. All these factors simultaneously influence the nucleic acids in vivo. Current biophysical methods for studying nucleic acids and their interactions rely on simplistic in vitro conditions that are inherently biased by the subjective choice of the experimental setup. Therefore, the obtained results cannot be directly translated to in vivo behaviour of studied species. This dissertation thesis describes the development and application of a novel approach based on the concept of in-cell NMR spectroscopy of nucleic acids. We established an effective methodology to study the structural behaviour of nucleic acids and their interactions directly in the complex intracellular environment of living mammalian cells. We demonstrated the ability of in-cell NMR to semi-quantitatively evaluate the stability of DNA structure in living human cells. We developed the method for characterization of the DNA-ligand interactions in an intracellular environment and showed its potential application in drug development. We also extended our technique for studying the stability of RNA with an unmodified backbone in living cells and subsequently, for investigation of the RNA-ligand interactions.

Keywords

in-cell NMR spektroskopie, vnitrobuňečné prostředí, i-motif, DNA, RNA, DNA-ligand interakce, RNA-ligand interakce, in-cell NMR, intracellular environment, DNA-ligand interaction, RNA-ligand interaction

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 13. 5. 2021
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Trantírek, Ph.D.
• Reader: Katja Petzold, PhD, Gilmar Salgado, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics