Funkční a biochemická analýza extracelulárních váčků z ascitů pacientek s karcinomem vaječníku

Mgr. Anna Vyhlídalová Kotrbová, Ph.D.

Doctoral thesis

Functional and biochemical analysis of extracellular vesicles from ovarian cancer ascites

Abstract:

Karcinom vaječníku (OC) je gynekologická malignita s nejvyšší mortalitou. OC nemá v ranných stádiích žádné specifické symptomy, nemoc je spojená s rychlou tvorbou metastáz a u mnoha pacientek dochází ke vzniku chemorezistence. Proto je velmi důležité porozumět molekulárním principům OC, abychom byli schopni vyvinout nové možnosti léčby a najít dostatečně citlivé a specifické biomarkery pro časnou detekci OC a monitorování jeho progrese. OC je souhrnný název pro skupinu nemocí, z nichž vyniká serózní ovariální karcinom vaječníků, vejcovodů a pobřišnice vysokého stupně (HGSC). HGSC je nejčastější (70% případů) diagnózou a také nejagresivnějším typem OC a je proto spojený s většinou úmrtí. Z tohoto důvodu se většina výzkumu soustředí právě na tento podtyp. Ascites je charakteristický znak OC. Je to nadbytečné hromadění tekutiny v břišní dutině, které napomáhá s rozvojem OC a obsahuje různé typy buněk, rozpustných faktorů, signálních molekul a extracelulárních vezikulů (EVs), které se výrazně podílí na komunikaci v rámci komplexního nádorového mikroprostředí (TME). Ascites je také skvělý zdroj TME, protože je pacientkám odebírán jako součást jejich léčby. V rámci svého doktorského studia jsem využila ascitu nejen k analýze jeho vlivu na buňky, ale také jsem charakterizovala jeho biochemické složení. Zjistila jsem, že ascites části pacientek obsahuje ligandy Wnt, především WNT5A, který je schopný díky aktivaci nekanonické signální dráhy Wnt podpořit pro-metastatické vlastnosti buněk OC, jako je růst sféroidů, migrace a invazivita. Primární nádorové buňky jsou schopné produkovat ligandy Wnt a přítomnost těchto ligandů v ascitu je spojená s horší prognózou pacientek. EVs jsou vezikuly s velikostí v řádech nanometrů, jsou obalené lipidovou dvoj-membránou a přenášejí různý obsah (proteiny, lipidy, nukleové kyseliny, metabolity) mezi buňkami. Mají tedy stěžejní roli v komunikaci v rámci TME. Díky jejich malé velikosti je třeba potvrdit, že byly správně izolovány, na což se často využívá transmisní elektronová mikroskopie (TEM). Charakterizace EVs pomocí TEM je však časově velmi náročná, proto jsem se spolupodílela na vývoji programu, který je schopný detekovat a charakterizovat EVs na obrázcích z TEM. V poslední části své práce jsem izolovala EV z ascitu dvěma různými metodami a analyzovala jejich proteinový obsah pomocí hmotnostní spektrometrie. Díky využití našeho nového postupu jsme byli schopni nejen identifikovat proteiny přítomné na EVs z ascitu, ale také vůbec poprvé určit, z jakých buněčných typů EVs z ascitů pacientek s OC pocházejí. Mnou získané poznatky významně přispívají ke znalostem v oblasti EV a také k detailnějšímu poznání HGSC. Pokládají tak pevné základy pro další experimenty a mají i translační potenciál.

Abstract:

Ovarian carcinoma (OC) is the deadliest gynecological malignancy. OC has no distinct symptoms in early stages, metastases develop quickly and the disease is often accompanied by development of chemoresistance. This stresses the need to understand the molecular principles of OC better, to develop novel treatment options and find sufficiently sensitive and specific biomarkers for early detection and monitoring of its progression. Among distinct diseases in the category called OC, high-grade serous carcinomas of the ovaries, fallopian tube and peritoneum (HGSC) stands out. HGSC is the most common (70% of cases) diagnosis and the most aggressive type that is associated with majority of OC deaths. Therefore, nearly all OC research focuses on this particular subtype. Ascites is a hallmark of OC. It is an excess accumulation of fluid in peritoneal cavity that facilitates rapid progression of OC and contains all types of cells, soluble factors, signaling molecules and extracellular vesicles (EVs) that enable or participate in complex communication network within OC tumor microenvironment (TME). Ascites is also great source of TME as it is removed as a part of therapy. During my PhD studies, I have exploited ascites and analyzed it both functionally and biochemically. I have found out that ascites of some patients contain Wnt ligands, especially WNT5A that can induce pro-metastatic traits like sphere formation, migration and invasion of OC cells via non-canonical Wnt signaling pathway. Wnt ligands can be secreted by primary cancer cells and their presence in ascites is associated with worse prognosis for the patients. EVs are nano-sized vesicles enclosed in lipid bilayer that convey various cargo (proteins, lipids, nucleic acids, metabolites) between cells and play crucial role in communication within TME. Due to their small size, their presence in isolates needs to be validated, often by transmission electron microscopy (TEM). Characterization of EVs by TEM is time consuming, therefore I assisted with development of a software capable of detecting and characterizing of EVs in TEM images. Lastly, I have isolated EVs from ascites by two different methods and analyzed their protein by mass spectrometry. Using our novel pipeline, we were able not only to identify true ascitic EV proteins, but also determine, for the first time, various cell types of origin of EVs in ascites of OC patients. As such, my findings contribute significantly to the field of EVs as well as to the knowledge of HGSC and lay solid foundations for further experiments with translational potential.

Keywords

ovariální karcinom, serózní karcinom vaječníků, vejcovodů a pobřišnice vysokého stupně (HGSC), ascites, signální dráha Wnt, WNT5A, extracelulární vezikuly, transmisní elektronová mikroskopie, hmotnostní spektrometrie, ovarian carcinoma, high-grade serous carcinomas of the ovaries, fallopian tube and peritoneum (HGSC), Wnt signaling, extracellular vesicles, transmission electron microscopy, mass spectrometry

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 10. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 4. 11. 2022
• Supervisor: RNDr. Vendula Hlaváčková Pospíchalová, Ph.D.
• Reader: Prof. Dr. rer. nat. Irina Nazarenko, Camille Bleriot, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology