Detekce a lokalizace estrogenových receptorů v samčí reprodukční soustavě

Bc. Pavlína Pernerová

Master's thesis

Detection and localization of estrogen receptors in the male reproductive system

Anotácia:

Estrogeny představují jednu z hlavních skupin hormonů, které mají schopnost regulovat reprodukční procesy. Ačkoliv jsou považovány především za samičí hormony, mají také velmi důležitou úlohu v samčí reprodukci. Do značné míry řídí spermatogenezi, zrání spermií, jejich kapacitaci, akrozomální reakci a fúzi s oocytem. Účinek estrogenů je zprostředkován vazbou na estrogenové receptory (ERs) v buňkách cílových tkání. V současné době jsou známé 3 typy estrogenových receptorů – ESR1, ESR2 a GPER. Lokalizace těchto receptorů ve spermiích je klíčem k pochopení účinků estrogenů na jejich vývoj, zrání a funkci. Tato práce byla zaměřena na detekci ERs ve spermiích v různých stádiích posttestikulárního zrání a v tkáni varlat a nadvarlat u dospělých kanců. V této práci se nám podařilo detekovat ESR1 u ejakulovaných a kapacitovaných kančích spermií na akrozomu, krčku a bičíku. U spermií po akrozomální reakci (AR) pozitivní signál ESR1 na akrozomu zanikl, avšak nově se objevil signál v postakrozomální oblasti, pozitivní detekce na bičíku přetrvávala. Při detekci ESR2 bylo zjištěno nejsilnější značení u ejakulovaných a kapacitovaných spermií na akrozomu, ekvatoriálním segmentu a krčku. U spermií po AR přetrvával intenzivní signál ESR2 pouze na krčku. U epididymálních spermií jsme zaznamenali detekci GPER na hlavičce a bičíku spermie. Dále byl GPER lokalizován na akrozomu, krčku a bičíku u ejakulovaných a kapacitovaných spermií. U spermií po AR byl lokalizován GPER v postakrozomální oblasti, krčku a bičíku, avšak u další zvolené protilátky proti GPER u AR spermií byl zjištěn negativní výsledek. Obecně v detekci byly zaznamenány rozdíly mezi použitými protilátkami, jež jsou zaměřené proti různým epitopům. Ve tkáních varlat a nadvarlat se nepodařilo získat specifické výsledky značení ERs. V proteinových extraktech ejakulovaných, kapacitovaných a AR spermií byla detekována jedna forma proteinu ESR1 o velikosti 52 kDa. ESR2 byl nalezen ve 3 zkrácených izoformách o molekulových hmotnostech 42 kDa, 35 kDa a 27 kDa. GPER byl detekován ve 4 izoformách o molekulových hmotnostech 80 kDa, 66 kDa, 43 kDa a 25 kDa. GPER byl detekován i v proteinových extraktech epididymálních spermiích, u kterých byly zjištěny 3 izoformy o molekulových hmotnostech 52 kDa, 43 kDa a 29 kDa. Hypotéza o detekci a lokalizaci ERs v odlišných fázích vývoje spermatických buněk byla potvrzena jen částečně. Některé výsledky se shodují s již publikovanými výsledky. Zásadní význam pro detekci ERs má zvolená metodika a zejména použití vybraných protilátek. Tato problematika není zcela probádaná v souvislosti s vlivem hormonů a endokrinních disruptorů na vývoj a zrání spermií a z tohoto důvodu se jeví velmi perspektivní věnovat se tomuto tématu v budoucnu nadále.

Abstract:

Estrogens are one of the main groups of hormones that have the ability to regulate reproductive processes. Estrogens are primarily considered as female hormones, but they also play a very important role in male reproduction. They are controlling to a large extent spermatogenesis, sperm maturation, their capacitation, acrosome reaction and fusion with the oocyte. The effect of estrogens is mediated by binding to estrogen receptors (ERs) in target tissue cells. Currently, 3 types of estrogen receptors are known - ESR1, ESR2 and GPER. The localization of these receptors in sperm, is a key to understanding the effects of estrogens on their development, maturation and function. This work was focused on the detection of ERs in sperm at various stages of post-testicular maturation and in testicular and epididymal tissue in adult boars. In this work, we were able to detect ESR1 on the acrosome, neck and flagellum in ejaculated and capacited boar sperm. In sperm after the acrosomal response (AR), the positive signal ESR1 on the acrosome disappeared, but a new signal appeared in the postacrosomal part, the positive detection on the flagellum persisted. Detection of ESR2 revealed the strongest staining in ejaculated and capacitated sperm on the acrosome, equatorial segment and neck. In sperm after AR, an intense ESR2 signal persisted only on the neck. In epididymal sperm, we detected GPER detection on the sperm head and flagellum. Furthermore, GPER was located on the acrosome, neck and flagellum in ejaculated and capacitated sperm. In sperm after AR, GPER was localized in the postacrosomal part, neck and flagellum, but another selected anti-GPER antibody in AR sperm was found to be negative. In general, differences have been noted in the detection between the antibodies used, which are focused against different epitopes. Specific test results for ERs could not be obtained in testicular and epididymal tissues. One 52 kDa form of ESR1 protein was detected in ejaculated, capacitated, and AR sperm protein extracts. ESR2 was found in 3 reduced isoforms with molecular weights of 42 kDa, 35 kDa and 27 kDa. GPER was detected in 4 isoforms with molecular weights of 80 kDa, 66 kDa, 43 kDa and 25 kDa. GPER was also detected in epididymal sperm protein extracts, in which 3 isoforms with molecular weights of 52 kDa, 43 kDa and 29 kDa were found. The hypothesis of detection and localization of ERs at different stages of sperm cell development was only partially confirmed. Some results match with the already published results. The chosen methodology and especially the use of selected antibodies is of fundamental importance for the detection of ERs. This issue is not fully explored in connection with the influence of hormones and endocrine disruptors on the development and maturation of sperm. For this reason it seems very promising to continue with this topic in the future.

Kľúčové slová

spermie, Western blot, imunofluorescenční mikroskopie, estrogenový receptor, varle, nadvarle

Keywords

immunofluorescence microscopy, estrogen receptor, testis, epididymis, sperm, Western blot

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: MVDr. Romana Krejčířová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology