Metody monitorující antimikrobiální účinky přírodních látek

Mgr. Rudolf Kukla

Doctoral thesis

Methods for monitoring of antimicrobial effects of natural substances

Abstract:

Dizertační práce byla zaměřena na zavedení vhodných metod pro stanovení antimikrobiálních účinků přírodních látek na mikroorganismy kontaminující vybraný živočišný biologický materiál. Jako modelový materiál jsme používali ejakuláty kanců. Testované látky jsme vybrali na základě informací uvedených v odborné literatuře a výsledků dosavadních experimentů pracovníků Katedry biologických a biochemických věd, Univerzity Pardubice a Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové. Nejprve jsme zavedli vhodné kultivační metody pro kvalitativní i kvantitativní průkaz mikroorganismů vyskytujících se v daném biologickém materiálu, konkrétně v ejakulátech kanců. Zavedli jsme a ověřili vhodnost metody pro stanovení antimikrobiální aktivity přírodních sloučenin včetně zjištění jejich účinných koncentrací. Rovněž jsme zavedli metodu pro stanovení antimikrobiálních účinků vybraných přírodních látek v jejich kombinaci. U látek s nejvyšší antimikrobiální aktivitou jsme zavedli metodu pro zjišťování jejich toxicity pro kančí pohlavní buňky. Na základě výsledků jsme vyhodnotili možnost použití přírodních látek k dekontaminaci ejakulátů kanců a případně pro další účely. Kultivačními metodami jsme prokázali, že všechny vyšetřené ejakuláty kanců byly kontaminovány mikroorganismy v různém kvalitativním a kvantitativním zastoupení. Mezi nejzávažnější patřily Pseudomonas aeruginosa, druhy z čeledi Enterobacteriaceae ? zejména Escherichia coli a Proteus mirabilis, dále stafylokoky, enterokoky a streptokoky. Ke zjišťování antimikrobiálních účinků přírodních látek jsme používali mikrodiluční metodu. Antimikrobiální aktivitu jsme ověřovali u 19 přírodních látek, silic a EDTA referenčními kmeny mikroorganismů a vybranými druhy bakterií a kvasinek vykultivovaných z ejakulátů kanců. Vzhledem k získaným výsledkům jsme dále testovali tyto látky přírodního původu, konkrétně thymol, karvakrol, eugenol, kyselinu gallovou, methyl-gallát, ethyl-gallát, propyl-gallát, oktyl-gallát, kyselinu usnovou a knicin. U těchto sloučenin jsme zjišťovali minimální inhibiční a minimální baktericidní koncentrace a také vzájemné interakce jejich dvojkombinací. Růst mikroorganismů použitých v naší práci nejlépe inhibovaly sloučeniny thymol, karvakrol a knicin. Grampozitivní bakterie byly inhibovány nízkými koncentracemi kyseliny usnové a oktyl-gallátu. Antimikrobiální účinky kombinací sloučenin byly nejvýraznější u směsi thymolu s EDTA, karvakrolu s EDTA a thymolu s karvakrolem. Nejnižší spermiotoxicitu vykazovaly látky karvakrol, thymol, eugenol, methyl-gallát a ethyl-gallát. U EDTA jsme toxické účinky na spermie nezaznamenali. Naše výsledky dokumentují, že pro dekontaminaci kančích ejakulátů lze použít thymol, karvakrol a zejména pak jejich vzájemné kombinace, s EDTA. Tyto látky a jejich kombinace jsou dostatečně účinné na většinu mikroorganismů kontaminujících ejakuláty kanců v koncentracích, při kterých zůstává zachována vitalita kančích spermií. Uvedené přírodní látky (thymol, karvakrol, eugenol, kyselina gallová, methyl-gallát, ethyl-gallát, propyl-gallát, oktyl-gallát, kyselina usnová a knicin) vykazují signifikantní antimikrobiální účinky a jsou vhodné pro další výzkum zabývající se problematikou léčby vybraných infekčních onemocnění člověka i zvířat.

Abstract:

The doctoral thesis was focused on the introduction and verification of convenient methods for the determination of antimicrobial activities of natural substances on microorganisms contaminating the selected animal biological material. Boar semen was used as model material. The tested substances were selected using the information provided in the scientific papers and the results of the experiments carried out by the staff of the Department of Biological and Biochemical Sciences, the University of Pardubice and the Faculty of Pharmacy of Charles University in Hradec Králové. We introduced cultivation methods for qualitative and quantitative determination of microorganisms contaminating boar semen. We verified methods for determining the antimicrobial activities of natural compounds, including the determination of their effective concentrations. We also introduced a method for determining the antimicrobial effects of selected natural substances in a combination. For substances with the highest antimicrobial activities, we introduced a method for detecting their toxicity for boar sperm cells. Based on the results, we evaluated the possibility to use of natural substances for boar semen decontamination or for other purposes. Using cultivation methods, we proved that all examined boar semen samples were contaminated by microorganisms in different qualitative and quantitative representations. Pseudomonas aeruginosa, family Enterobacteriaceae species - Escherichia coli and Proteus mirabilis and also staphylococci, enterococci and streptococci were included among the most serious pathogens. For the determination of the antimicrobial activities of natural substances, we selected the microdilution method. Antimicrobial activities were verified in case of 19 natural substances, essential oils and EDTA on reference bacterial strains and selected bacterial and yeast strains isolated from boar semen. In the view of the results obtained, we had further tested thymol, carvacrol, eugenol, gallic acid, methyl gallate, ethyl gallate, propyl gallate, octyl gallate, usnic acid, knicin and their mutual combinations. For these compounds, we determined minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations, as well as interactions with their double combinations. We found thymol, carvacrol and knicin as the most potent inhibitors of microorganisms. Gram-positive bacteria were inhibited in low concentrations of usnic acid and octyl gallate. The antimicrobial effects of the combination of compounds were the most pronounced in the thymol mixture with EDTA, carvacrol with EDTA and thymol with carvacrol. The lowest spermiotoxicity was observed for carvacrol, thymol, eugenol, methyl gallate and ethyl gallate. We found no negative effect of EDTA for boar sperm cells. Our results show that thymol, carvacrol and their combinations, including combinations with EDTA, can be used for the boar semen decontamination. These compounds and their combinations are effective enough for the most microorganisms contaminating boar semen in concentrations in which boar sperm cells remain vital. The natural substances mentioned above (thymol, carvacrol, eugenol, gallic acid, methyl gallate, ethyl gallate, propyl gallate, octyl gallate, usnic acid and knicin) show the significant antimicrobial effects and may be used not only in the artificial insemination process, but also in the treatment of selected infectious diseases.

Keywords

přírodní látky, minimální inhibiční koncentrace, minimální baktericidní koncentrace, toxicita pro kančí spermie, mikroorganismy, mikrodiluční metoda

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 9. 2017

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Doctoral programme / field:
Analytical Chemistry / Analytical Chemistry