Studium antiradikálové aktivity fenolových kyselin a jejich vlivu na redoxní stav železa a mědi

Mgr. Kateřina Chvátalová, Ph.D.

Doctoral thesis

Research of antiradical activity of phenolic acids and their effect on the redox state of iron and copper

Abstract:

Disertační práce se zabývá kinetickým stanovením antiradikálové aktivity antioxidantů, zejména fenolových kyselin, a jejich vlivem na redoxní stav iontů přechodných kovů, železa a mědi. Antiradikálová aktivita byly hodnocena na základě výpočtu rychlostních konstant reakce antioxidantů se stabilními radikály, použili jsme měření s nadbytkem radikálu i s nadbytkem antioxidantu. Narozdíl od dosud používaných metod, založených např. na výpočtu koncentrace antioxidantu, která zháší 50 % částic radikálu, je velkou výhodou, že hodnota rychlostní konstanty lépe vypovídá o tom, jakou rychlostí reagují radikál s antioxidantem. Stanovení jsme prováděli s radikály DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl), ABTS (diamonná sůl kyseliny 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonové)) a DMPD (4-amino-N,N-dimethylanilin dihydrochlorid). Pro každý antioxidant jsme nejprve stanovili řád a rychlostní konstantu reakce s radikály. U některých fenolových kyselin za nadbytku radikálu se reakce místo očekávaného 2. řádu řídila kinetikou 1. řádu. Stanovili jsme i tzv. antiradikálovou kapacitu, tedy počet částic radikálu zhášených jednou molekulou antioxidantu. Antiradikálová kapacita ani antiradikálová aktivita nesouvisela přímo s počtem hydroxylových skupin vázaných na aromatickém jádře fenolových kyselin, jak se běžně uvádí, ale souvisí spíše s aktivitou nejvíce aktivovaného fenolového hydroxylu. Porovnali jsme vlastnosti různých stabilních radikálů a posoudili možnosti jejich použití při kinetickém stanovení. Radikál DPPH je stabilní, velmi vhodný pro kinetické stanovení, jeho nevýhodou je, že není rozpustný ve vodě, stanovení se prování v methanolu. Radikály ABTS a DMPD jsou rozpustné ve vodě. Oproti DPPH je radikál ABTS méně stabilní, dochází u něj k samovolnému zhášení, a lze s ním stanovovat aktivitu jen u slabších antioxidantů. Radikál DMPD nelze při pH 7,4 použít. Sledovali jsme tvorbu komplexů fenolových kyselin s ionty přechodných kovů, konkrétně Fe3+, Fe2+, Cu2+, Cu+, a dále jejich vliv na redoxní stav těchto iontů při fyziologickém pH 7,4. Ionty železa a mědi tvořily komplexy s fenolovými kyselinami, které mají ve své struktuře ortho-dihydroxy- neboli katecholové seskupení nebo 1,2,3-trihydroxy- seskupení. V komplexech s fenolovými kyselinami jsou ionty železa většinou jako oxidované - Fe3+ a ionty mědi ve formě redukované - Cu+. Většina polyfenolů urychlovala samovolnou oxidaci iontů Fe2+, šlo o polyfenoly s katecholovým seskupením. Výjimkou byly kyseliny s jedním fenolovým hydroxylem, které autooxidaci zpomalovaly (kyselina syringová, kyselina vanilová, kyselina 3-hydroxybenzoová a kyselina 4-hydroxybenzoová), stejně jako kyselina askorbová a cystein. Fenolové kyseliny s jedním hydroxylem však neredukovaly Fe3+ na Fe2+, pouze kyselina syringová částečně redukovala Fe3+.

Abstract:

Presented dissertation thesis studies the kinetic determination of the anti-radical activity of antioxidants, mainly phenolic acids, and their influence on the redox state of ions of the transition metals, iron and copper. We developed a method for the determination of the antioxidant activity, which is based on calculation of the rate constants of the reactions, we used measurements with both excess of the radical and the antioxidant. In difference to methods used up to the present days, based e.g. on the calculation of the concentration of an antioxidant, which extinguishe 50 % of the radical particles, it is a great advantage, that the value of the rate constant better informs us about the speed, in which a radical reacts with an antioxidant. We used three radicals, DPPH, ABTS and DMPD. At first we determined the order of the reaction with the radicals. For some phenolic acids the reaction was running according to first order kinetics instead of proposed second order kinetics. We determined also the so called antiradical capacity. Antiradical capacity is the number of the radical particles extinguished by one molecule of antioxidant. Both, the antiradical capacity and antiradical activity, does not directly depend on the number of the hydroxyl groups bound to the aromatic ring of the phenolic acids, as commonly stated, but corresponds more with the activity of the most activated phenolic hydroxyl. We compared the properties of the various stable radicals and evaluated the possibilities of their use for the kinetic determination. Radical DPPH is highly stable, very convenient for the kinetic determination, its disadvantage is that it is insoluble in the water, the determination is carried out in methanol. ABTS and DMPD radicals are soluble in water. However, the ABTS radical is less stable then DPPH, it is spontaneously extinguished and the activity could be measured only in case of weaker antioxidants. The DMPD can not be used at pH 7,4. We observed the formation of complexes of phenolic acids with ions of the transition metals, specifically Fe3+, Fe2+, Cu2+, Cu+, and how the phenolic acids influence the redox state of these ions in the aqueous solution at physiological pH 7.4. Ions of iron and copper form complexes with phenolic acids, which have the ortho-dihydroxy- (catechoyl-) arrangement or 1,2,3-trihydroxy- (galloyl-) arrangement in their structure. Iron ions are most often found in their oxidated form - Fe3+ in the complexes with phenolic acids, whereas the copper ions in the reduced form - Cu+. The majority of polyphenols speed up the spontaneous oxidation of Fe2+ ions. The exceptions are monophenolic acids, which slow down the autooxidation process, similarly to ascorbic acid and cysteine. Phenolic acids with one hydroxyl group did not reduced Fe3+ to Fe2+, only syringic acid is able partially reduce Fe3+.

Keywords

Phenolic acids, DPPH, ABTS, DMPD, Iron, Copper, Autooxidation, fenolové kyseliny, železo, měď, autooxidace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 1. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 29. 1. 2007
• Supervisor: Mgr. Jiří Slanina, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
General Medicine / Medical Chemistry and Biochemistry