Výskum funkcie rastlinného hormonálneho receptoru CRE1/AHK4 za použitia automatizovanej metódy pre vysokoúčinný skríning

Romana Kopecká

Bachelor's thesis

Výzkum funkce rostlinného hormonálního receptoru CRE1/AHK4 za použití automatizované metody pro vysokoúčinný skríning

Abstract:

Práce byla zaměřená na možnosti využití vysokoúčinného skríningu (high-throughput screening, HTS) pro výzkum funkce rostlinného hormonálního receptoru AHK4. Pro studium signalizace receptoru AHK4 byly využity bakterie Escherichia coli (kmen KMI001), které exprimují beta-galaktosidázu jako reportérový enzym v závislosti na interakci mezi receptorem a ligandem. Mezi hlavní výhody použité HTS metody patří identifikace agonistů, antagonistů a látek neinteragujících s receptorem v jednom experimentu a možnost identifikace falešně pozitivních výsledků (převážně látek rušících fluorescenční stanovení enzymatického produktu, 4-metylumbelliferonu). V experimentální části práce byly studovány účinky 279 neznámých látek na receptor AHK4. Součástí experimentu byla také bližší charakteristika vybraných látek na receptor AHK4. Pro tento účel byla naprogramována metoda, která umožnila ředění látek s využitím přístroje Nanodrop II. Na základě analýzy dat bylo zjištěno, že ve vybrané části knihovny látek se vyskytly látky se statisticky signifikantním agonistickým nebo antagonistickým účinkem, které ale nedosahovaly účinku kontrolních látek (tZ, ZOGA). V detailnější charakterizaci látek ze skríningu byl v některých případech potlačen agonistický účinek. Tento jev byl pravděpodobně důsledkem absence tZ, který byl přítomný v primárním skríningu.

Abstract:

The bachelor thesis is focused on the possibilities of using high-throughput screening (HTS) for the research of plant hormone receptor AHK4 functions. For the study of AHK4 receptor signaling was used Escherichia coli (strain KMI001) which express beta-galactosidase as a reporter enzyme based on the receptor-ligand interaction. The main advantages of used HTS method include the identification of agonists, antagonists and non-receptor interacting agents in one experiment and the possibility of identifying false-positive results (predominantly fluorescence determination of the enzyme product, 4-metylumbelliferon). The effects of 279 unknown substances on the AHK4 receptor were studied in the experimental part. A part of the experiment was also a closer characterization of selected substances with agonist effect on the AHK4 receptor. Within this section, a method has been developed that has allowed the dilution of selected 12 substances using Nanodrop II. On the basis of data analysis, it was found that selected substances with a statistically significant agonist or antagonist effect in the selected part of the substance library did not achieve the effects of the control substances (tZ, ZOGA). In a more detailed characterization of the screening agents, the agonist effect was suppressed in some cases. This phenomenon was probably caused by the absence of tZ, which was present in the primary screening.

Abstract:

Práca bola zameraná na možnosti využitia vysokoúčinného skríningu (high-throughput screening, HTS) pre výskum funkcie rastlinného hormonálneho receptoru AHK4. Pre štúdium signalizácie receptoru AHK4 boli využité baktérie Escherichia coli (kmeň KMI001), ktoré exprimujú beta-galaktozidázu ako reportérový enzým v závislosti na interakcii medzi receptorom a ligandom. Medzi hlavné výhody použitej HTS metódy patrí identifikácia agonistov, antagonistov a látok neinteragujúcich s receptorom v jednom experimente a možnosť identifikácie falošne pozitívnych výsledkov (prevažne látok narúšajúcich fluorescenčné stanovenie enzymatického produktu, 4-metylumbelliferonu). V experimentálnej časti práce boli študované účinky 279 neznámych látok na receptor AHK4. Súčasťou experimentu bola taktiež bližšia charakterizácia vybraných látok na receptor AHK4. Pre tento účel bola naprogramovaná metóda, ktorá umožnila riedenie látok s využitím prístroja Nanodrop II. Na základe analýzy dát bolo zistené, že vo vybranej časti knižnice látok sa vyskytli látky so štatisticky signifikantným agonistickým alebo antagonistickým účinkom, ktoré ale nedosahovali účinok kontrolných látok (tZ, ZOGA). V detailnejšej charakterizácii látok zo skríningu bol v niektorých prípadoch potlačený agonistický účinok. Tento jav bol pravdepodobne dôsledok absencie tZ, ktorý bol prítomný v primárnom skríningu.

Keywords

Escherichia coli, Nanodrop II, fluorescence, AHK4, skríning

Keywords

Escherichia Coli, AHK4, Nanodrop II, fluorescence, screening

Keywords

Escherichia coli, skríning, Nanodrop II, fluorescencia, AHK4

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Pavel Klimeš

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Bachelor programme / field:
Agrobiology / Molecular biology and biotechnology