Proteiny spermií a jejich role v průběhu post-testikulární maturace a při vazbě na zona pellucida oocytu

Ing. Lucie Tůmová

Doctoral thesis

Sperm proteins and their role during the post-testicular maturation and zona pellucida binding

Abstract:

Spermie musí projít řadou vývojových a maturačních událostí, než získají schopnot navázat se na zona pellucida (ZP) a oocyt oplodnit. Pro správný vývoj a funkci spermií je nezbytná jak stimulace pohlavními hormony prostřednictvím jejich specifických receptorů, tak i změny v proteinovém složení především na plazmatické membráně v rámci post-testikulární maturace. Klíčovou maturační událostí je zejména kapacitace spermií, která je spojena s reorganizací plazmatické membrány, redistribucí a odstraňováním proteinů lokalizovaných na povrchu spermie. V důsledku těchto změn jsou na povrchu spermií vystaveny proteiny, z nichž některé jsou zapojeny do primární vazby na ZP oocytu. Primární vazba spermií na ZP je u většiny savců zásadní, neboť předchází dějům, jež vedou k fúzi obou gamet a úspěšnému oplození. Přesná lokalizace estrogenových receptorů je významná pro pochopení jejich funkce ve spermiích savců. Detekovali jsme estrogenové receptory v ejakulovaných spermiích býků, konkrétně ESR1 uvnitř akrozomu a ESR2 v apikální části nad akrozomální membránou a v krčku spermií. Přítomnost estrogenových receptorů na ejakulovaných býčích spermiích vypovídá o jejich možném zapojení do procesů spojených s kapacitací spermií. Povrchový β-mikroseminoprotein (MSMB) je jedním z proteinů, jež v průběhu kapacitace kančích spermií odchází. Do průběhu kapacitace je zapojen ubiquitin-proteasomový systém (UPS). UPS je významný regulační mechanismus, který degraduje proteiny. Spermie jsme in vitro kapacitovali za podmínek inhibujících proteasom a za podmínek inhibujících enzym aktivujícího ubiquitin. Neprokázali jsme však vliv inhibice proteasomu ani inhibice ubiquitinace na akumulaci MSMB u in vitro kapacitovaných spermií. Nepodařilo se nám detekovat ani případné polyubiquitinované formy MSMB. Zaměřili jsme se na detekci možné interakce MSMB s vybranými ligandy. Ze získaných výsledků můžeme předpokládat, že MSMB v průběhu kapacitace z povrchu spermie odchází spolu se spermadhesinem AWN-1, rovněž poukazují na možnou glykosylaci MSMB. Jedním z proteinů, který byl na povrchu kančích spermií detekován i po kapacitaci je laktadherin (p47). Na základě předpokladu, že je p47 zapojen do vazby spermií na ZP oocytu u prasat, jsme blokovali vazbu spermií na ZP oocytu s použitím protilátky proti p47. Podařilo se nám částečně zablokovat vazbu p47 k ZP a získané výsledky tak vedou k potvrzení předpokladu o jeho zapojení do vazby spermií na ZP oocytu. Studium proteinů spermií v rámci všech maturačních událostí má v oblasti asistované reprodukce určité výhody, například pro vytváření nových postupů, jež mohou zlepšit fertilizační potenciál spermií. Identifikace vazebných proteinů může sloužit jako vhodný marker fertility spermií jak v reprodukci zvířat, tak i v diagnostice lidské neplodnosti.

Abstract:

Spermatozoa must undergo a series of developmental and maturation events before they acquire ability to bind to the zona pellucida (ZP) and fertilize the oocyte. For the sperm development and function, it is necessary stimulation by sex hormones through specific receptors as well as changes in protein composition, especially in the plasma membrane, during the post-testicular maturation. The key maturation event is sperm capacitation that is associated with plasma membrane reorganization, rearrangement and removal of proteins localized on the sperm surface. Due to these changes, proteins are exposed to the sperm surface and some of them are involved in the primary binding to the ZP of the oocyte. The primary sperm-ZP binding is essential in most mammals because leads to the fusion of both gametes and successful fertilization. The localization of estrogen receptors is important for understanding their function in mammalian spermatozoa. We detected estrogen receptors in ejaculated bull sperm, namely ESR1 inside the acrosome and ESR2 in the apical part above the acrosomal membrane and also in the sperm neck. The presence of estrogen receptors in ejaculated bull spermatozoa suggest their possible involvement in processes associated with sperm capacitation. Sperm surface β-microseminoprotein (MSMB) is one of the boar proteins that is removal during the capacitation. The ubiquitin-proteasome system (UPS) is involved in the process of capacitation. UPS is an important regulatory mechanism that degrades proteins. We in vitro capacitated spermatozoa under proteasomal inhibition and ubiquitin-activating enzyme inhibition. However, we did not prove the effect of UPS inhibition on any MSMB accumulation in in vitro capacitated spermatozoa. We also did not detect any polyubiquitinated forms of MSMB. We focused on the possible interaction of MSMB with selected ligands. From our results we suppose that MSMB is removal from the sperm surface during capacitation together with AWN-1 spermadhesin. Our results also indicate a possible glycosylation of MSMB. One of the proteins that has been detected on the boar sperm surface after capacitation is lactadherin (p47). Based on the assumption that p47 is involved in the sperm-ZP binding in pigs, we blocked sperm binding to the ZP of oocyte by using an anti-p47 antibody. We partially blocked the binding of p47 to ZP and our results lead to the confirmation that p47 is involve in the sperm-ZP binding. The study of sperm proteins in all maturation events has advantages in the assisted reproduction, for example in the development of new procedures that could improve the fertilizing capacity of spermatozoa. The identification of binding proteins may serve as a sperm fertility marker in animal reproduction and in the diagnosis of human infertility.

Keywords

spermie, protein, maturace, kapacitace, zona pellucida

Keywords

spermatozoa, protein, maturation, capacitation, zona pellucida

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 8. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.
• Reader: Michal Ješeta, doc. Ing., Ph.D., Jana Pěknicová, Bc., externi, Katarína Michalková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme:
Animal Science