Transformace rostlin vojtěšky za účelem přípravy transgenních linií exprimujících fluorescenčně značený MMK3 protein a linií s vyřazeným MMK3 proteinem

Bc. Kateřina KRÁLIKOVÁ

Bachelor's thesis

Transformation of alfalfa plants to prepare transgenic lines expressing the fluorescently labeled MMK3 protein and the deleted MMK3 protein lines

Abstract:

Mitogenem aktivované protein kinasy patří mezi fosforylační enzymy, na jejichž aktivaci se podílejí například hormony nebo biotický a abiotický stres. Vzniká mezi nimi signalizačí dráha, která vede k expresi specifických genů souvisejících s odpovědmi na stresové a neoptimální podmínky prostředí. Mitogenem aktivovaná protein kinasa MMK3 je součástí buněčného dělení, a také signalizačních kaskád souvisejících se stresem. Tato bakalářská práce se zaobírá transformacemi rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens. Cílem práce byla příprava transientně transformovaných rostlin tabáku, v jehož listových buňkách byl pozorován fluorescenčně značený MMK3 protein pomocí GFP nebo mRFP proteinu. Dále byly stabilně transformovány rostliny Medicago sativa, do kterých byly vneseny konstrukty ověřené u N. benthamiana se značeným MMK3 proteinem nebo Crispr/Cas9 konstrukty pro vyřazení MMK3 proteinu. Regenerace stabilně transformovaných rostlin probíhala prostřednictvím somatické embryogeneze. Pro ověření, zda se podařilo jednotlivé rostliny transformovat, byly použity metody genotypizace, Western blot a v případě rostlin s fluorescenčně značeným MMK3 proteinem také fluorescenční mikroskopie. Dále byla provedena fenotypová analýza kořenů mpk13 mutantů Arabidopsis thaliana. Na základě výsledků byla zjištěna lokalizace fluorescenčně značeného MMK3 proteinu v listových buňkách N. benthamiana a to zejména v jádře a cytoplazmě. Z výsledků genotypizace stabilně transformovaných rostlin M. sativa s vyřazeným MMK3 proteinem je zřejmé, že v některých rostlinách byl transgen přítomen. Na základě této genotypové analýzy byla vybrána nejvhodnější rostlina M. sativa a podrobena Western blotové analýze. Výsledky předběžně ukazují úbytek MMK3 proteinu a jeho kompenzaci pSIMK.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinases are phosphorylating enzymes and for example hormones or biotic and abiotic stress are involved in their activation. A signaling pathway arises between them, which leads to the expression of specific genes associated with responses to stressful and non-optimal environmental conditions. Mitogen-activated protein kinase MMK3 is involved in cell division as well as stress-related signaling cascades. This bachelor thesis deals with plant transformations using Agrobacterium tumefaciens. The aim of the work was to prepare transiently transformed Nicotiana benthamiana plants in whose leaf cells fluorescently labeled MMK3 protein was observed using GFP or mRFP protein. Furthermore Medicago sativa plants were stably transformed with constructs verified previously in N. benthamiana for MMK3 labeled protein or for knock-out mutant using Crispr/Cas9. Regeneration of stably transformed plants was performed by somatic embryogenesis. Genotyping methods, Western blotting and in the case of plants with fluorescently labeled MMK3 protein the fluorescence microscopy were used to verify that individual plants which were successfully transformed. Furthermore a phenotypic analysis of the roots of mpk13 mutants of Arabidopsis thaliana was performed. Based on the results the localization of fluorescently labeled MMK3 protein in N. benthamiana leaf cells was determined especially in the nucleus and cytoplasm. From the genotyping results of stably transformed M. sativa plants with the Crispr/Cas9 constructs it is clear that the transgene was present in some plants. Based on this genotypic assay the most suitable M. sativa plant was selected and subjected to Western blot analysis and results preliminary show lack of MMK3 protein and its compensation via pSIMK.

Keywords

Medicago sativa, MMK3, MAP kinasy, transformace, Agrobacterium tumefaciens, somatická embryogeneze, AtMPK13, Crispr/Cas9, GFP

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 7. 7. 2020
• Supervisor: Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering