Transcriptomic and physiological response of environmental bacterium and green microalgae to engineered iron nanoparticles

Cheryl Soo Yean Yeap

Doctoral thesis

Abstract:

Nanoscale zero-valent iron (nZVI) has increasingly been applied to remediate aquifers polluted by organochlorines or heavy metals and was also suggested for the elimination of harmful cyanobacterial blooms. As a result, microorganisms in the vicinity of the remediation can be stressed by the surplus of iron released from nZVI. To date, the toxicity of iron nanoparticles (NPs) has been evaluated on numerous microorganisms. Although different endpoints were measured, the regulation of gene expression related to iron stress defense pathways have not been described sufficiently. This thesis, therefore, aimed to compare the biological effect of different forms of iron including reactive nZVI, non-reactive nFe3O4, and dissolved iron obtained from nZVI suspension on an environmental bacterium, and two green microalgae. Pseudomonas putida NCTC 10936 was exposed to 100 mg/L of nZVI, and 44.5 ?g/L of iron released from 100 mg/L of nZVI. Green microalgae, Raphidocelis subcapitata ATCC 22662, and Chlamydomonas reinhardtii wild type CC-5325 were exposed to 100 mg/L of either nZVI or nFe3O4. The physiological endpoints (cell morphology and viability, photosynthetic activity, phytochrome content) provided a baseline of stress levels before transcriptomic studies were performed. The transcriptomic analysis required optimization of RNA extraction protocols that was challenging due to the presence of reactive nZVI and high polysaccharide content in microalgae. Sufficient RNA integrity was finally reached and transcriptomic analysis of P. putida was performed after 6 h and 24 h-exposure and R. subcapitata after 1 h and 4 h-exposure to iron NPs. In the P. putida study, cell viability was neither affected by nZVI nor dissolved iron, although the dissolved iron caused stress that altered the cell physiology and caused the generation of smaller cells, whereas cells were elongated in the presence of nZVI. The transcriptomic analysis confirmed the observed stronger physiological effect caused by dissolved iron (in total 3839 differentially expressed genes [DEGs]) than by nZVI (945 DEGs). Dissolved iron (but not nZVI) activated genes involved in oxidative stress-related pathways, antioxidant activity, carbohydrate, and energy metabolism, but downregulated genes associated with flagellar assembly proteins and two-component systems involved in sensing external stimuli. As a result, bacteria very effectively faced oxidative insults, and cell viability was not affected. In the microalgae study, nZVI and nFe3O4 affected differently R. subcapitata and C. reinhardtii. C. reinhardtii displayed more decreased viability, as well as lower non-photochemical quenching (NPQ) than R. subcapitata upon the NPs exposure. NPs attachment on both microalgae was observed after 1 h which might later result in deformed cell morphology or leakage of cytosol in about 15% of R. subcapitata and 20-30% of C. reinhardtii cells within the first 24 h. Under a darker environment containing nFe3O4 and nZVI, the NPQ was lower (30% lower comparing to control after 1h) which corresponds to a decrease in gene expression related to energy transportation that was probably needed to increase photosynthesis efficiency. nZVI exposure triggered a more pronounced transcriptomic response than nFe3O4 in R. subcapitata after 1 h including DNA repair response, while such response diminished quickly later at 4 h indicating a fast adaptive response to stress insults. However, the inhibition effect was only temporary, R. subcapitata was able to recover thereafter due to a surplus of CO2, generation of new cells, and oxidation of nZVI which then became less harmful.

Abstract:

Nanočástice nulamocného železa (nZVI) se mohou využívat například k sanaci území znečištěných chlorovanými organickými sloučeninami nebo těžkými kovy a také na likvidaci sinicového vodního květu. Při sanačním zásahu jsou mikroorganizmy vystaveny vyšším koncentracím železa uvolněného z nZVI. Toxicita nanočástic železa byla hodnocena na mnohých mikroorganizmech, nicméně regulace exprese genů souvisejících s obrannými mechanizmy dosud úplně prostudována nebyla. Cílem této práce proto bylo porovnat biologický účinek různých forem železa, včetně reaktivního nZVI, nereaktivního nFe3O4 a rozpuštěného železa získaného ze suspenze nZVI na bakterie a zelené řasy. Pseudomonas putida NCTC 10936 byla vystavena 100 mg/l nZVI a 44,5 ?g/l železa uvolněného ze 100 mg/l nZVI. Zelené řasy, Raphidocelis subcapitata ATCC 22662 a Chlamydomonas reinhardtii CC-5325 byly vystaveny 100 mg/l buď nZVI nebo nFe3O4. Fyziologické parametry (morfologie a životaschopnost buněk, fotosyntetická aktivita, obsah fytochromů) poskytly výchozí hodnoty stresových hladin před provedením transkriptomických analýz. Transkriptomická analýza vyžadovala optimalizaci protokolu pro izolaci RNA, což bylo náročné kvůli přítomnosti reaktivního nZVI a vysokého obsahu polysacharidů v řasách. Po dosažení dostatečné kvality izolované RNA byla provedena analýza transkriptomu P. putida po 6 a 24-hodinové expozici a R. subcapitata po 1 h a 4-hodinové expozici nanočásticím. Ve studii P. putida nebyla životaschopnost buněk ovlivněna ani nZVI, ani rozpuštěným železem, ačkoli rozpuštěné železo způsobovalo stres, který se projevoval tvorbou menších buněk, zatímco buňky byly naopak v přítomnosti nZVI prodloužené. Transkriptomická analýza potvrdila pozorovaný větší fyziologický účinek způsobený rozpuštěným železem (celkem 3839 rozdílně exprimovaných genů [DEG]) v porovnání s nZVI (945 DEG). Rozpuštěné železo (nikoli však nZVI) aktivovalo geny, které se podílejí na odpovědi na oxidační stres, antioxidační aktivitě, energetickém metabolizmu, na regulaci růstu bičíků a systémy podílejícími se na vnímání vnějších podnětů. V důsledku toho bakterie velmi účinně čelily oxidačnímu stresu a životaschopnost buněk nebyla ovlivněna. R. subcapitata a C. reinhardtii byly různě ovlivněné nZVI a nFe3O4. U C. reinhardtii došlo k snížení životaschopnosti buněk a také vykazovala nižší hodnoty nefotochemického zhášení (non-photochemical quenching, NPQ) než R. subcapitata. Na obou řasách byla pozorována adsorpce nanočástic po 1 hodině, což později mohlo mít za následek deformaci buněk nebo únik cytosolu u přibližně 15 % buněk R. subcapitata a 20-30 % buněk C. reinhardtii během prvních 24 hodin. V tmavším prostředí obsahujícím nFe3O4 a nZVI byla hodnota NPQ nižší (o 30 % ve srovnání s kontrolou po 1 h), což by mohlo odpovídat poklesu exprese genů souvisejících s transportem energie, která byla pravděpodobně využitá pro zvýšení účinnosti fotosyntézy. nZVI vyvolalo výraznější odpověď na úrovni exprese genů než nFe3O4 v R. subcapitata po 1 h, přičemž se exprese genů po 4 h rychle snížila, což naznačuje rychlou adaptivní reakci na oxidační stres. Účinek nZVI byl tedy pouze dočasný, kultura R. subcapitata se dokázala rychle zotavit díky nadbytku CO2, tvorbě nových buněk a oxidaci nZVI, které se poté stalo méně škodlivým.

Keywords

nanočástice nulamocného železa, nanočástice magnetitu, rozpuštěné železo, toxicita, oxidační stres, bakterie, zelené řasy, transkriptom, poškození a oprava DNA, metabolizmus sacharidů, obranný mechanizmus

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Alena Ševců, Ph.D.

Technical University of Liberec

Technical University of Liberec

Doctoral programme / field:
Nanotechnology / Nanotechnology