Genotypová analýza boreliální DNA izolované z klíšťat a klinického materiálu

Bc. Dominika Melničuková

Diplomová práce

Genotype analysis of borrelial DNA isolated from ticks and clinical material

Abstract:

The etiological agent of a multisystem infectious disease Lyme borreliosis is a bacterium - spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato, whose main vector is the Ixodes ricinus tick in Europe. For prediction of the risk of human infection, which depends on the density of the tick population and on the occurrence of borrelia in ticks, the isolation of Borrelia from the ticks is required. Europe is dominated by species B. afzelii which induces mainly skin manifestations and B. garinii, which is manifested mostly through neurological symptoms. The occurrence of B. burgdorferi sensu stricto is uncommon. The diagnosis is based on epidemiological history, clinical symptoms and the results of auxillary examinations. Due to problems with diagnosis of borreliosis, we focused on improving diagnostics using genetic methods. The main aim of our study was to compare the occurrence of individual species of Borrelia in ticks and in clinical material. Detection of B. burgdorferi sensu lato DNA in the ticks included two-step PCR, in which several borrelial DNA fragments suitable for the typing study were amplified. In the clinical material, borrelial DNA was detected by amplification of the 5S-23S rRNA locus. In positive samples, the amplicons were sequenced by the dideoxynucleotideterminator method using the original amplification primers to determine Borrelia species. A total of 469 ticks from 4 localities were examined. The total Borrelia prevalence in ticks was 20.3%. The incidence of B. afzelii was 33.7%, B. garinii 20%, B. valaisiana 16.8%, B. burgdorferi sensu stricto 10.5% and B. bavariensis 8.4%. Detection of the 16S-23S rRNA locus was able to reveal the presence of B. miyamotoi, the prevalence of which was 2.1%. From the clinical material, 146 samples of whole blood and 118 CSF samples from 116 pediatric patients with suspected lyme borreliosis, where the diagnosis was based on epidemiological history and clinical symptomatology, were examined. 8.9% of full blood and 5.1% of CFS samples were positive for borrelial DNA presence. The incidence of B. garinii was 15.8%, B. afzelii 15.8% and B. burgdorferi sensu stricto 68.4%. All samples of B. garinii, one sample of B. afzelii and 5 samples of B. burgdorferi sensu stricto revealed a sequence difference when compared to control samples.

Abstract:

Etiologickým agens multisystémového infekčního onemocnění lymeská borelióza je bakterie - spirochéta Borrelia burgdorferi sensu lato, jejímž hlavním vektorem v Evropě je klíště Ixodes ricinus. Pro předpověď rizika nákazy lidí, které závisí na hustotě populace klíšťat a na její promořenosti boréliemi, je významná izolace borelií z klíšťat. V Evropě dominují druhy Borrelia afzelii vyvolávající zejména kožní projevy a Borrelia garinii, která se manifestuje nejčastěji neurologickými projevy. Méně častý je výskyt Borrelia burgdorferi sensu stricto. Diagnóza se stanoví na podkladě epidemiologické anamnézy, klinického obrazu a výsledků pomocných vyšetření. Vzhledem k problémům se stanovením diagnózy boreliózy jsme se zaměřili na zlepšení diagnostiky za použití genetických metod. Hlavním cílem naší práce bylo srovnání výskytu jednotlivých druhů borelií v klíšťatech a v klinickém materiálu. Detekce genetického materiálu B. burgdorferi sensu lato v klíšťatech zahrnovala dvoukrokovou PCR, při níž bylo amplifikováno několik úseků boreliální DNA vhodných pro provedení typizační studie. V klinickém materiálu byla boreliální DNA detekována amplifikací lokusu 5S-23S rRNA. U pozitivních vzorků byly amplikony sekvencovány dideoxynukleotidterminátorovou metodou s pomocí původních amplifikačních primerů s cílem určit druh přítomné borelie. Celkem bylo vyšetřeno 469 klíšťat ze 4 lokalit. Celková prevalence borelií v klíšťatech činila 20,3 %. Výskyt B. afzelii byl u 33,7 % klíšťat, B. garinii u 20 %, B. valaisiana u 16,8 %, B. burgdorferi sensu stricto u 10,5 % a B. bavariensis u 8,4 % klíšťat. Detekcí lokusu 16S-23S rRNA se podařilo zachytit B. miyamotoi, jejíž prevalence byla 2,1 %. Z klinického materiálu bylo vyšetřeno 146 vzorků plné krve a 118 vzorků mozkomíšního moku od 116 dětských pacientů s podezřením na lymeskou boreliózu, u kterých bylo podezření založeno na epidemiologické anamnéze a klinické symptomatologii. U vzorků plné krve představoval pozitivní záchyt boreliální DNA 8,9 % a u vzorků mozkomíšního moku 5,1%. Záchyt B. afzelii činil 15,8 %, B. garinii 15,8 % a B. burgdorferi sensu stricto 68,4%. U všech vzorků B. garinii, jednoho vzorku B. afzelii a u 5 vzorků B. burgdorferi sensu stricto byla zjištěna sekvenční změna oproti kontrole.

Klíčová slova

Borrelia burgdorferi sensu lato, Borrelia miyamotoi, PCR, klíště, klinický materiál, tick, clinical material

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 19. 6. 2017
• Vedoucí: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Lékařská genetika a molekulární diagnostika pro odborné pracovníky v laboratorních metodách