Modulace intracelulárních signálních drah a genové exprese aromatickými kontaminanty prostředí

Mgr. Lenka Trilecová, Ph.D.

Disertační práce

Modulation of intracellular signaling pathways and gene expression by aromatic environmental contaminants

Anotace:

Polycyklické aromatické uhlovodíky (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAH) a N heterocyklické aromatické uhlovodíky (N-heterocyclic Aromatic Hydrocarbons; N HAH) tvoří rozsáhlou skupinu významných kontaminantů životního prostředí. Do organismu se tyto sloučeniny dostávají prostřednictvím kontaminované potravy, vody a dýcháním znečištěného vzduchu, zvláště inhalací cigaretového kouře. V játrech dochází k jejich metabolické aktivaci na mnohdy reaktivnější deriváty, jež napadají významné makromolekuly jako jsou proteiny, lipidy a DNA. Po vstupu do buněk se PAH a N-HAH váží na specifický aryluhlovodíkový receptor (Aryl hydrocarbon receptor, AhR), který je tak aktivován a v komplexu s pomocnými proteiny vstupuje do buněčného jádra, kde se váže na dioxin-responsní elementy v regulační části cílových genů. Výsledkem je aktivace exprese řady genů včetně cytochromů P450 (CYP450) a aldoketoreduktas, jež se podílejí na biotransformaci a případné metabolické aktivaci PAH a N-HAH. V organismu mohou mít všechny tyto sloučeniny různě silné genotoxické a nádorově promoční účinky. Ty jsou dány řadou mechanismů působení jako je indukce tvorby reaktivních forem kyslíku (ROS) a aduktů DNA, modulace buněčného cyklu a proliferace spojená s aktivací (fosforylací) proteinů regulujících zástavu buněčného cyklu, apoptosu aj. Všechny tyto účinky mohou v konečném důsledku vést ke vzniku a rozvoji nádorů. Cílem této práce bylo nejprve charakterizovat genotoxické a nádorově promoční účinky methylovaných benzo[a]pyrenů (MeBaP) a methylovaných benz[a]anthracenů (MeBaA) v potkaní jaterní epitheliální linii WB-F344. Tato buněčná linie představuje model jaterních progenitorových buněk, jež se mohou stát cílem chemických karcinogenů a hrát roli v hepatokarcinogenesi. MeBaP měly silné genotoxické účinky, jež se projevovaly především tvorbou aduktů DNA, která byla doprovázena zpomalením buněčného cyklu. Indukční potence klesaly v pořadí 1- > 11- > 6- > 3- > 10-MeBaP. AhR-dependentní genová exprese přímo nekorelovala s genotoxickými účinky a zpomalením buněčného cyklu (1- = 3- > 10- > 6- > 11-MeBaP). Byla prokázána také produkce reaktivních forem kyslíku a u 6-MeBaP oxidativní poškození DNA. Nejsilnějšími induktory apoptosy byly 1-, 3-, 6- a 11-MeBaP. MeBaA byly silnými aktivátory AhR a proliferace (9- > 6- > 7- > 8-MeBaA), inhibovaly GJIC, ale nebyly u nich prokázány genotoxické účinky. Získaná data in vitro ukazují, že mohou být silnými nádorovými promotery. V další práci byly studovány účinky benzo[a]pyrenu (BaP) a 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu (TCDD) na expresi a aktivitu enzymů podílejících se na metabolické aktivaci a enzymů uplatňujících se při oxidativním stresu. Exprese enzymů byla porovnána s expresí v AhR-pozitivních a AhR-negativních jaterních buněčných liniích. BaP a TCDD indukovaly vysoké hladiny enzymů CYP1A1, CYP1B1, NQO1 a AKR1C9. Bylo zjištěno, že exprese CYP1A1 je plně kontrolována AhR, CYP1B1 a AKR1C9 je částečně závislá na přítomnosti AhR a indukce NQO1 nezávisí na AhR. V lidských nádorových prostatických liniích LNCaP, DU-145 a PC-3 bylo cílem popsat účinky silného mutagenu BaP a modelového aktivátoru AhR, TCDD a pokusit se objasnit přežívání buněčné linie LNCaP po genotoxickém poškození. BaP ve studované linii neindukoval apoptosu, zástavu buněčného cyklu ani aktivaci proteinu p53. Genotoxicky poškozené buněčné linie tak přežívaly s akumulací poškozené DNA. V poslední práci jsme chtěli poukázat na účinky vybraných N-HAH – dibenzokarbazolu a jeho derivátů (DBC, N MeDBC, di-MeDBC) v jaterní buněčné linii WB-F344, které byť se vyskytují v životním prostředí v nízkých koncentracích, mají význ

Anotace:

amné mutagenní a hepatokarcinogenní účinky. U sledovaných látek se projevily rozdílné mechanismy působení. Systémový karcinogen DBC působil genotoxickými účinky (tvorba aduktů DNA, zlomů a mikrojader) a opravné mechanismy nastupovaly pomalu ve srovnání s efekty derivátů N-MeDBC a di-MeDBC. U di-MeDBC se genotoxické poškození neprojevilo tak výraznou tvorbou aduktů DNA jako u DBC a zlomy DNA byly opraveny relativně rychle. Příčinou genotoxického působení může být oxidativní poškození DNA. Genotoxická poškození po působení N-MeDBC se neprojevila na buněčné úrovni. Potence aktivovat AhR a AhR-dependentní genovou expresi byla stanovena metodou DR-CALUX® v buněčné linii H4IIE.Gud.Luc jako indukce aktivity reportérového genu luciferasy. V buněčné linii WB-F344 byla AhR-dependentní exprese genů CYP1A1, CYP1B1 a AKR1C9 detekována metodou real-time PCR (RT-PCR). Modulace buněčného cyklu, tvorba ROS a apoptosa (značení Annexinem-V-Fluos a propidium jodidem) byla detekována průtokovou cytometrií. Apoptosa byla detekována také fluorescenční mikroskopií (jako fragmentace jader). Tvorba aduktů DNA byla měřena metodou 32P-postlabelingu na pracovišti genetické ekotoxikologie Ústavu experimentální medicíny AV ČR, v.v.i v Praze. Přítomnost sledovaných proteinů byla detekována metodou Western blotting.

Abstract:

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and N-heterocyclic aromatic hydrocarbons (N HAHs) represent large group of considerable environment contaminants. These compounds enter organism in contaminated food, water and polluted air especially by inhalation of cigarette smoke. In liver, metabolic activation often leads to formation of reactive derivatives which attack important macromolecules e.g. proteins, lipides and DNA. PAHs and N-HAHs bind to specific aryl hydrocarbon receptor (AhR) after entering the cell. The AhR is activated and in complex with helper proteins it translocates to nucleus, where it binds to dioxine-response elements in regulatory parts of target genes. This results in activation of gene expression including cytochrome P450 (CYP450) and aldo-keto reductases which participate on biotransformation and eventually on metabolic activation of PAHs and N-PAHs. Each of these compounds can have variably strong genotoxic and tumor-promotion effects in organism. These effects are given by number of effecting mechanisms e. g. induction of reactive oxygen species (ROS) and DNA adducts formation, modulation of cell cycle and proliferation related to activation (phosphorylation) of proteins regulating cell cycle arrest, apoptosis, etc. Finally, all these effects can lead to formation and progress of tumors. The goal of this study was to characterise genotoxic and tumor-promotion effects of methylated benzo[a]pyrenes (MeBaPs) and methylated benz[a]anthracenes (MeBaAs) in rat liver epithelial cell line WB-F344. This cell line presents model of liver progenitor cells, which can become a target of chemical carcinogens and play a role in hepatocarcinogenesis. MeBaPs had strong genotoxic effects which were expressed by DNA adducts formation. Cell cycle arrest went along with this DNA adducts formation. The induction potencies descended respectively 1- > 11- > 6- > 3- > 10-MeBaP. AhR-dependent gene expression did not corelate directly with genotoxic effects and cell cycle arrest (1- = 3- > 10- > 6- > 11-MeBaP). The production of reactive oxygen species was demonstrated. In addition formation of oxidative DNA was demonstrated for 6-MeBaP. The strongest inductors of apoptosis were 1-, 3-, 6- and 11-MeBaP. MeBaAs were strong activators of AhR and proliferation (9- > 6- > 7- > 8-MeBaA). They inhibited GJIC but they did not prove to cause genotoxic effects. The collected data indicate that it is possible that they can be strong tumor promoters. The goal of other study was to study effects of benzo[a]pyrene (BaP) and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) on expression and activity of enzymes participating on metabolic activation and enzymes asserting in oxidative stress. Expression of enzymes was compared to expression in AhR-positive and AhR-negative hepatoma cell lines. BaP and TCDD induced high levels of CYP1A1, CYP1B1, NQO1 and AKR1C9 enzymes. The CYP1A1 expression was fully controlled by AhR, expression of CYP1B1 and AKR1C9 was partially dependent on presence of AhR. Induction of NQO is not AhR-dependent. In human tumor prostate cell lines LNCaP, DU-145 and PC-3 the goal was to describe effects of strong mutagen BaP and model activator of AhR, TCDD and demonstrated survival of cell line LNCaP after genotoxic damage. In study line, BaP did not induce apoptosis, cell cycle arrest and neither p53 protein activation. Cell lines with genotoxic damage survived with accumulation of damaged DNA. In the last study we wanted to point to effects of selected N-HAHs – dibenzocarbazole and its derivates (DBC, N-MeDBC, di-MeDBC) in cell line WB-F344, which are present in low concentration in environment, but they have considerable mutagenic and hepatocarcinogenic effects. Different behavioral mechanisms were demonstrated in observed compounds. The system carcinogen DBC had genotoxic effects (DNA adducts formation, breaks and micronucleus), repair mechanisms started slowly in comparison with its derivatives N

Abstract:

-MeDBC and di-MeDBC. Di-MeDBC genotoxic damage did not demonstrate as strong DNA adducts formation as with DBC but DNA breaks were repaired relatively quickly. Oxidative DNA damage can be caused by genotoxic treatment. Genotoxic damages in N-MeDBC did not demonstrate on cell level. The potency to activate AhR and AhR-dependent gene expression was determined by DR-CALUX® method in H4IIE.Gud.Luc cell line as induction of reporter gene luciferase activity. In cell line WB-F344, the AhR-dependent gene expression was CYP1A1, CYP1B1 and AKR1C9 genes detected by real-time PCR method (RT-PCR). Modulation of cell cycle, formation of ROS and apoptosis (labeled by Annexin-V-Fluos and propidium iodide) was detected by flow cytometry. Apoptosis was also detected by fluorescent microscopy also (as fragmentation of nucleus). The formation of DNA adducts was measured by 32P postlabelling method on Department of Genetic Ecotoxikology in Institute of Experimental Medicine AS CR, v.v.i in Prague. The presence of watched proteins was detected by Western blotting method.

Klíčová slova

polycyklické aromatické uhlovodíky, genotoxické a nádorově promoční účinky, aryluhlovodíkový receptor, cytochromy P450, modulace buněčného cyklu, apoptosa, oxidativní stres, oxidační poškození DNA, oprava DNA.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 9. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 5. 2012
• Vedoucí: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Oponent: Dr. Pavel Rössner Jr., Ph.D., doc. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie