Zavedení metody pro izolaci exozómů z lidské krve

Bc. Michaela Gállová

Master's thesis

Development of Method for Exosomes Isolation From Human Blood

Abstract:

Táto diplomová práca je zameraná na zavedenie systému izolácie exozómov, pomocou ktorej by bolo možné detegovať tieto EVs z ľudskej krvi. Tento Systém je založený na kombinácii imunoanalýzy magnetickej separácie na báze imunoprecipitácie a imunochemickej detekcie vyizolovaných exozómov komerčným izolačným kitom. Princíp separácie spočíva v reakcii antigénu v podobe povrchových proteínov na exozómoch so špecifickými monoklonálnými a polyklonálnymi protilátkami imobilizovanými na komerčných magnetických časticiach namierených proti týmto exozomálnym proteínom. Prítomnosť exozómov vo vzorkách séra je detegovaná metódou Semi-Dry Western blot pomocou sekundárnych protilátok značených chrenovou peroxidázou (HRP) pre chemiluminiscenčnú detekciu po predchádzajúcom rozdelení proteínov SDS-PAGE analýzou. Konečným overením prítomnosti exozómov vo vyizolovanej frakcii je hmotnostná analýza po proteolytickom naštepení proteínov z gélu modifikovaným trypsínom.

Abstract:

This diploma thesis is focused on the introduction of a system of isolation of exosomes, which could be used to detect these EVs from human blood. This system is based on a combination of magnetic separation immunoassay based on immunoprecipitation and immunochemical detection of isolated exosomes with a commercial isolation kit. The principle of separation is the reaction of antigen in the form of surface proteins on exosomes with specific monoclonal and polyclonal antibodies immobilized on commercial magnetic particles directed against these exosomal proteins. The presence of exosomes in serum samples is detected by Semi-Dry Western blot using horseradish peroxidase (HRP) labeled secondary antibodies for chemiluminescent detection after pre-separation of the proteins by SDS-PAGE analysis. The final verification of the presence of exosomes in the isolated fraction is the mass analysis after proteolytic digestion of the proteins from the gel with modified trypsin.

Keywords

Exozómy, extracelulárne vezikuly, imunoprecipitácia, magnetické častice, polyklonálne a monoklonálne protilátky, SDS-PAGE, Semi-Dry Western blot analýza, ľudské sérum

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 7. 2020

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Bioanalyst