Mutageneze lektinu RS20L z fytopatogenu Ralstonia solanacearum

Mgr. Lucie Olšová

Bachelor's thesis

Mutagenesis of lectin RS20L from phytopathogen Ralstonia solanacearum

Abstract:

Předmětem výzkumu v této bakalářské práci byl lektin RS20L produkovaný bakterií Ralstonia solanacearum, který svou strukturou připomíná galektiny, ale jeho sekvence nevykazuje podobnost s žádnou z doposud známých aminokyselinových sekvencí. Při purifikaci tohoto rekombinantního lektinu na mannan-agarosové koloně se setkáváme s faktem, že se mannosa naváže do vazebného místa lektinu, čímž dojde k vytvoření abnormálně stabilního komplexu lektinu s cukrem. Ve snaze obejít tvorbu komplexu se jeví možným řešením připojení histidinové kotvy k N-terminálnímu konci proteinu, aby mohla být provedena jeho purifikace pomocí metody metalochelatační afinitní chromatografie. Řešení tohoto problému bylo obsahem této bakalářské práce. V teoretické části byly charakterizovány základní vlastnosti lektinů a jejich rozdělení podle různých kriterií. V rámci lektinů patogenních organismů byla zvláštní pozornost věnována lektinu RS20L. První část praktické práce, kde bylo cílem zmutovat expresní vektor pRSET-rs20L tak, aby obsahoval oligohistidinovou doménu, i přes veškeré optimalizační kroky nebyla úspěšná. V druhé etapě práce proběhlo klonování uměle připraveného rekombinantního genu RS20L s již zaměněnými páry bází, které ztotožnily sekvence přírodního i rekombinantního genu, do vektorů pET-32c a pET-25b. V tomto případě se pravděpodobně podařilo připravit expresní vektory, i když na potvrzení správnosti sekvence ještě čekáme. V případě kladného výsledku klonování by mohla být provedena optimalizace exprese a purifikace tohoto rekombinantního proteinu a to zejména bez použití mannosy, čímž bychom zajistili dostatečné množství materiálu pro jeho funkční charakterizaci. Zároveň protein, byť obsahující mannosu, ale s optimalizovaným genetickým kódem (produkt pET-25b-RS20L) by byl použit pro krystalizační experimenty.

Abstract:

The task of laboratory research in my thesis was lectin RS20L produced by bacterium Ralstonia solanacearum, which resembles galectins in their structure but its sequence is not similar to any up-to-date-known amino acid sequence. Purification of this recombinant lectin on mannose-agarose column shows that mannose binds strongly to the binding place of lectin and thus creates extremely firm lectin-saccharide complex. The way how to overcome complex formation can be in change of purification principle. The new purification approach is based on usage metallochelatic affinity chromatography on Ni-NTA without using mannose. The thesis is focused on solving this problem. In the theoretic part, basic characteristics of lectins were described and their division according to various criteria was specified. Within the lectins of pathogenic organisms special attention was focused on lectin RS20L produced by bacterium R. solanacearum. The aim of the first experimental part was to mutate vector pRSET-rs20L by attaching oligohistidine tag. This part was not successful. In the second part of work the synthetic gene of RS20L, in which some pairs of basis were changed to match sequences of natural and recombinant gene, was cloned into pET-32c and pET-25b vectors. In this case, cloning was successful, but we are still waiting for confirmation by sequencing. If result of cloning will be positive, the optimization of expression and purification of this recombinant protein without mannose could be carried out. Thereby enough quantity of material will be ensured for functional studies. And protein containing mannose, but with optimised genetic code (pET-25b-RS20L) could be used for crystallization experiments.

Keywords

lektiny, Ralstonia solanacearum, lektin RS20L

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry