Identification of cancer stem cells in cell lines derived from selected types of solid tumors.

RNDr. Jan Škoda, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Podle modelu nádorových kmenových buněk (CSCs) jsou tyto buňky zdrojem nádorového růstu a jsou proto považovány za příčinu relapsu a progrese nádorových onemocnění. Terapeutické strategie, které by byly zaměřeny na CSCs, by mohly v budoucnu zvýšit efektivitu protinádorové léčby a zároveň snížit její toxicitu. Prvním a nezbytným krokem pro dosažení takových léčebných metod je však identifikace fenotypu, který v jednotlivých typech nádorů specificky odliší CSCs. Tato dizertační práce shrnuje výsledky vlastních studií, jejichž cílem bylo identifikovat CSCs u duktálního adenokarcinomu pankreatu (PDAC) a nejčastějších pediatrických sarkomů. Pro dané účely byly využity markery, které byly dříve popsány jako specifické pro CSCs u těchto nebo podobných typů nádorů. U pediatrických sarkomů byla analyzována exprese CD133, ABCG2 a nestinu. U PDAC pak exprese CD24, CD44, EpCAM, CD133 a nestinu. V rámci všech experimentů byly využity buněčné linie derivované z primárních nádorů odebraných pacientům s příslušným typem nádoru, což umožnilo porovnat výsledky získané in vitro s expresí markerů CSCs v příslušné nádorové tkáni a korelovat tyto výsledky s klinickým průběhem onemocnění daného pacienta. Ačkoliv exprese CD133, ABCG2 nebo nestinu byla dříve považována za specifický marker CSCs, naše výsledky prokázaly, že tyto proteiny nemají u pediatrických sarkomů potenciál rozlišit CSCs. Naopak, testy tumorigenicity in vivo naznačily, že pouze buňky, které vykazují zvýšené hladiny Sox2, jsou zodpovědné za tumorigenezi sarkomů. Signální dráhu Sox2 lze proto u pediatrických sarkomů zvažovat jako vhodný cíl nových protinádorových léčiv. Přestože CD133 ani nestin nepředstavovaly vhodné markery CSCs, zvýšená exprese CD133 byla identifikována jako významný negativní prognostický faktor u Ewingova sarkomu a nestin byl obdobně asociován s horším přežitím u rabdomyosarkomu. Jak u pediatrických sarkomů, tak u PDAC byla navíc objevena atypická intracelulární lokalizace některých z navrhovaných markerů CSCs, zejména CD133, což nově poukazuje na možné a dosud neprozkoumané funkce těchto molekul v buněčné signalizaci. V neposlední řadě pak analýza markerů CSCs u PDAC vůbec poprvé prokázala v lidských buněčných liniích derivovaných z primárních nádorů pankreatu přítomnost buněk s fenotypem CD24+/CD44+/EpCAM+/CD133+. Ačkoliv se obecně tyto buňky vyskytovaly v podmínkách in vitro ve velkém počtu, jejich zvýšené zastoupení v rámci buněčné linie korespondovalo s pro tumorigenním expresním profilem. Z výsledků studií souhrnně prezentovaných v této práci tak vyplývá, že význam dříve navrhovaných markerů CSCs spočívá spíše v jejich možném využití pro účely stanovení prognózy onemocnění než pro identifikaci CSCs samotných. Nalezení selektivnějších markerů, jako např. Sox2, je proto nezbytné pro další výzkum CSCs.

Abstract:

According to the cancer stem cell (CSC) model, CSCs are responsible for driving the tumor growth and are considered a cause of tumor relapse and disease progression. Therefore, therapeutic strategies targeting these cells might increase effectiveness of anticancer therapy and could provide a reduction of its toxicity. Identification of a phenotype that specifically defines CSCs in an individual tumor type represents the essential step toward such treatment options. This dissertation summarizes the results of our studies that sought to identify CSCs in the most frequent pediatric sarcomas and in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). For this purpose, we used CSC markers that were previously described in these or related tumor types. Expression of CD133, ABCG2 and nestin was analyzed in pediatric sarcomas; CD24, CD44, EpCAM, CD133 and nestin were examined in PDAC. In all experiments, we used cell lines derived directly from primary tumors of patients with the respective tumor types. This gave us a unique opportunity to compare results obtained in vitro with the expression of CSC markers in the respective tumor tissues, and correlate these results with patient clinical outcome. We demonstrated that expression of CD133, ABCG2 or nestin does not have potential to distinguish CSCs in pediatric sarcomas, despite these proteins were previously proposed as CSC markers. In contrast, in vivo tumorigenicity assays strongly suggested that only the cells displaying high levels of Sox2 are key mediators of sarcoma tumorigenesis. Thus, the Sox2 pathway could be considered as a target for new anticancer drugs in pediatric sarcomas. Although not useful as CSC markers, CD133 and nestin were identified as significant negative prognostic factors in Ewing’s sarcoma and rhabdomyosarcoma, respectively. In addition, atypical subcellular localization of certain putative CSC markers, especially CD133, was described in both sarcomas and PDAC, providing novel insights into possible functions of these molecules in cell signaling. Finally, we were the first to demonstrate that CD24+/CD44+/EpCAM+/CD133+ cells are present in human PDAC cell lines derived from primary tumors. Although these cells were common under in vitro conditions, we showed that their increased proportion corresponded to a pro-tumorigenic gene expression profile. To conclude, our results suggest that previously described CSC markers are more informative with regard to the clinical outcome or tumor progression than to the CSC phenotype. Defining more selective markers, such as Sox2, is needed for further investigations of CSCs.

Keywords

nádorové kmenové buňky, cancer stem cells, sarkomy dětského věku, pediatric sarcomas, osteosarkom, osteosarcoma, Ewingův sarkom, Ewing's sarcoma, rabdomyosarkom, rhabdomyosarcoma, duktální adenokarcinom pankreatu, pancreatic ductal adenocarcinoma, marker, Sox2, CD133, ABCG2, nestin

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 3. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 22. 4. 2016
• Supervisor: prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D.
• Reader: prof. MUDr. Jiří Ehrmann, Ph.D., MUDr. Aleš Vícha, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology