Fixační metody pro sledování fosforylovaných proteinů v kančích spermiích pomocí imunofluorescenční mikroskopie

Bc. Petra Černá

Diplomová práce

Fixation methods for monitoring of phosphorylated proteins in boar spermatozoa using imunofluorescent microscopy

Anotace:

K získání schopnosti fertilizace kančích spermií je nezbytné, aby podstoupily kapacitaci a s ní spojené biochemické a biofyzikální změny na plazmatické membráně a uvnitř spermie. Kapacitace představuje konečné maturační kroky, které činí savčí spermie kompetentní k oplodnění oocytu, buď in vivo nebo in vitro. Umožňuje spermiím vázat se na oocyt a podstoupit akrosomální reakci v reakci na zona pellucida. Mezi další biochemické dráhy spojené s kapacitací patří hyperaktivace a tyrosinová fosforylace, která je stěžejní událostí v kapacitaci, ačkoli nejsou zcela známy její molekulární mechanismy. Fosforylace proteinů hraje důležitou roli v regulaci mnoha buněčných aktivit. Tyrosinová fosforylace je jeden z nejvyužívanějších a nejlepších markerů kapacitace. Cílem práce byla optimalizace metody fixace pro imunofluorescenční mikroskopii pro sledování změn ve vzorech fosforylovaných proteinů v kančích spermiích před a po proběhlé in vitro kapacitaci. Cíl této práce vychází z hypotézy, že budou detekovány rozdíly ve vzorech tyrosinové (P-Tyr) a serinové (P-Ser) fosforylace v ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermiích za použití různých fixací. V této diplomové práci byla detekována P-Tyr a P-Ser pomocí specifických protilátek. Pro detekci fosforylace proteinů ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií byly provedeny odlišné typy fixace za použití různých chemikálií. Fixace je jedním z nejdůležitějších kroků při imunoznačení proteinů. V této diplomové práci byly detekovány dvě skupiny fosforylačních vzorů, a to nekapacitované spermie (fosforylace v subekvatoriálním segmentu) a kapacitované spermie (fosforylace v subekvatoriálním segmentu a akrosomu). Dle našich výsledků jsme došli k závěru, že u všech provedených fixací nelze s jistotou tvrdit, že fosforylace detekovaná v akrosomu, je markerem kapacitace. U všech fixací byl u in vitro kapacitovaných spermií převažující vzor fosforylace v akrosomu, ale u ejakulovaných spermií byly četnosti fosforylačních vzorů vyrovnané, nebo také s převahou fosforylace v akrosomu. Pouze fixace formaldehydem ukázala jasnou rozdílnost ve fosforylačních vzorech mezi ejakulovanámi a in vitro kapacitovanými spermiemi. Z našich výsledků tedy vyplývá, že nejlepší fixační systém pro detekci kapacitace dle fosforylačních vzorů, je fixace formaldehydem. Úplně nejlépe vyšla fixace s 2% formaldehydem ve vodě s BSA. Z našich výsledků také vyplývá, že díky velké různorodosti fosforylačních vzorů v rámci různých fixací, nelze usoudit, který fosforylační vzor je markerem kapacitace u P-Ser. U všech fixací byla viditelně detekována zvýšená fosforylace proteinů u in vitro kapacitovaných spermií. A pro kančí spermie je typická serinová fosforylace zvláště v bičíku. Navíc byly detekovány proteiny v extraktech z ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií, které byly fosforylovány na tyrosinu a serinu. U kapacitovaných spermií docházelo k silnějšímu signálu proteinových proužků, což dokládá zvýšení tyrosinové i serinové fosforylace na některých proteinech při kapacitaci spermií. Z celkových výsledků je patrné, že jsou přítomny rozdíly ve vzorech tyrosinové a serinové fosforylace kančích ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií. Ejakulované spermie vykazovaly signifikantní rozdíl v tyrosinové fosforylaci subekvatoriálního segmentu a akrosomu od in vitro kapacitovaných spermií. Ve všech experimentech byl pozorován zvyšující se trend fosforylace proteinů během in vitro kapacitace.

Abstract:

In order to be fertile it is necessary for boar spermatozoa to undergo capatication and related biochemical and biophysical changes in plasma membrane and inside of spermatozoa. Capacitation represents the final maturation steps that render mammalian spermatozoa competent to fertilize, either in vivo or in vitro. Capacitation enables sperm to bind the oocyte and undergo the acrosome reaction in response to the zona pellucida. Other biochemical pathways associated with capacitation include hyperactivation motility and tyrosine phosphorylation, which is crucial event in capacitation, although the molecular mechanisms involved are not fully understood. Protein phosphorylation plays an important role in regulating numerous cellular activities. Tyrosine phosporylation is one of the most used and best marker of capatication. The aim of this thesis was to optimize the method of fixation for immunofluorescence microscopy to monitori the changes in patterns of phosphorylated proteins in boar spermatozoa before and after in vitro capacitation. The aim of this thesis is based on the hypothesis that differences in tyrosine (P-Tyr) and serine (P-Ser) phosphorylation patterns will be detected in ejaculated and in vitro capacitated spermatozoa using various fixations. In this Diploma thesis P-Tyr and P-Ser were detected using specific antibodies. Different types of fixation were performed using various chemicals to detect tyrosine phosphorylation of both ejaculated and in vitro capacitated sperm proteins. Fixation is one of the most important steps in protein immunostaining. In this Diploma thesis two groups of phosphorylation patterns were detected, namely non-capacitated spermatozoa (phosphorylation in the subequatorial segment) and capacitated spermatozoa (phosphorylation in the subequatorial segment and acrosome). According to our results, we conclude that for all performed fixations it cannot be assured with certainty that phosphorylation detected in acrosome is a marker of capacitation. In all fixations, the pattern of acrosome phosphorylation was the predominant pattern of in vitro capacitated spermatozoa, but in ejaculated spermatozoa, the phosphorylation pattern rates were balanced, or even with acrosome phosphorylation. Only formaldehyde fixation showed clear differences in phosphorylation patterns between ejaculated and in vitro capacitated spermatozoa. Therefore, our results show that the best fixation system for capacitation detection by phosphorylation patterns is formaldehyde fixation. Fixation with 2% formaldehyde in water with BSA was best. Our results show that due to the wide variety of phosphorylation patterns in different fixations, it cannot conclude which phosphorylation pattern is a marker of P-Ser capacitation. In all fixations, increased protein phosphorylation was visibly detected in in vitro capacitated spermatozoa. And for boar spermatozoa, serine phosphorylation is typical, especially in flagella. In addition, proteins were detected in extracts from ejaculated and in vitro capacitated spermatozoa that were phosphorylated on tyrosine and serine. In the case of capacitated spermatozoa, there was a stronger signal of the protein bands, demonstrating an increase in both tyrosine and serine phosphorylation on some proteins in the sperm capacitation. The overall results show that there are differences in the patterns of tyrosine and serine phosphorylation of boar ejaculated and in vitro capacitated spermatozoa. Ejaculated sperms showed a significant difference in tyrosine phosphorylation of the subequatorial segment and acrosome from in vitro capacitated spermatozoa. In all experiments, an increasing trend of protein phosphorylation during in vitro capacitation was observed.

Klíčová slova

kančí spermie, fosfotyrosin, fosfoserin, kapacitace

Keywords

boar spermatozoa, phosphotyrosine, phosphoserine, capacitation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie