Role homocysteinu a příbuzných thiolů u poruch reprodukce

MUDr. Michaela Králíková, Ph.D.

Disertační práce

The role of homocysteine and related thiols in fertility disorders

Anotace:

Disertační práce se zabývá stanovením homocysteinu a metabolicky příbuzných thiolů a vitaminů u mužů i žen v souvislosti s poruchami plodnosti. Thioly studované v této práci (homocystein, cystein, cysteinylglycin a glutathion) jsou aminokyseliny a peptidy obsahující sulfanylovou skupinu. Tyto sloučeniny jsou významné pro udržení redoxní homeostázy a při antioxidační obraně organismu. Jsou také významnými intermediáty a prekurzory řady metabolických drah. Narušený metabolismus thiolů je spojen s oxidačním stresem a se zvýšeným rizikem mnoha onemocnění, včetně poruch lidské plodnosti. Nadměrná produkce volných radikálů vede k poškození plazmatické membrány a DNA buněk, včetně pohlavních, a negativně tak ovlivňuje jejich funkci. Cílem práce bylo vyvinout metodiku a stanovit koncentraci homocysteinu a ostatních thiolů a vitaminu B12 a kyseliny listové u mužů v seminální tekutině a intracelulárně ve spermiích a zjistit vztahy mezi nimi, parametry spermiogramu a mírou poškození DNA. U žen pak zjistit koncentrace v krevní plazmě a folikulární tekutině, sledovat změny při ovariální stimulaci a rozdíly mezi folikuly s oocytem a bez něj a také zjistit míru intraindividuální varibility mezi jednotlivými folikuly dané pacientky. Všechna stanovení a klinické studie byly prováděny na vzorcích tělních tekutin získaných od pacientů Centra asistované reprodukce FN Brno. Pro stanovení koncentrace thiolů v krevní plazmě a folikulární tekutině byla využita metoda HPLC s fluorescenční detekcí používaná na Biochemické ústavu LF MU. Pro stanovení koncentrace thiolů v seminální tekutině a intracelulárně ve spermiích bylo zapotřebí vyvinout a optimalizovat jiný HPLC postup. Ten je charakterizován CV 1,78 % pro seminální tekutinu a CV 1,58 %, bias 0,82 % a TE 0,12 mol/l pro roztok standardu homocysteinu o koncentraci 3,125 mol/l. Byl také vyvinut účinný postup pro lýzu spermií a získání jejich intracelulárního obsahu resuspendací spermií v 80 % methanolu, inkubací a pětinásobným zmrazením a rozmrazením v ultrazvukové lázni. U části probandů bylo sledováno poškození DNA spermií pomocí mikroelektroforetické metody kometové analýzy. Na Oddělení klinické biochemie a hematologie FN Brno byla ve vzorcích seminální tekutiny a krevního séra stanovena koncentrace folátů a vitaminu B12 pomocí elektrochemiluminiscenční imunoeseje. Získané intracelulární koncentrace thiolů ve spermiích jsou, nejspíše z důvodu opravdu účinného rozbití spermií a získání kompletního intracelulárního obsahu, o tři až pět řádů vyšší než publikované. Byly nalezeny statisticky významné rozdíly v koncentracích vitaminů a thiolů v seminální tekutině mezi jednotlivými skupinami pacientů dle výsledku vyšetření spermiogramu a významné korelace parametrů spermiogramu s koncentracemi vitaminů a thiolů v seminální tekutině a thiolů ve spermiích. Zvláště zřetelné jsou negativní korelace koncentrace spermií s intracelulárními koncentracemi thiolů a závislost stupně pohybu spermií na intracelulární koncentraci thiolů s náznakem podobného trendu s koncentracemi v seminální tekutině. Koncentrace cysteinu a homocysteinu ve spermiích koreluje s jejich koncentrací v seminální tekutině. S koncentrací v krevní plazmě nebyla nalezena žádná korelace, toto stanovení proto pro vyšetření mužské fertility zřejmě nemá význam. Byla zjištěna významně nižší míra poškození integrity DNA spermií u normospermiků než u pacientů s poruchami spermiogramu. Také byl nalezen vliv suprafyziologických koncentrací homocysteinu v ejakulátu na integritu DNA spermií, statisticky významný u normospermiků. Všechny tyto výsledky svědčí pro významný vliv thiolů na kvalitu spermiogramu, a tedy schopnost fertilizace. U že

Anotace:

n byl potvrzen pokles hladin thiolů v krvi po ovariální stimulaci FSH. Byly nalezeny statisticky významné rozdíly v koncentracích cysteinu a glutathionu mezi folikuly s a bez oocytu. Koncentrace homocysteinu a cysteinylglycinu byly vyšší ve folikulech bez oocytu, ale rozdíly nebyly statisticky významné. Hlavním zjištěním u žen byla vysoká intraindividuální variabilita folikulárních koncentrací všech thiolů, bez ohledu na to, zda se jednalo o folikuly s oocytem nebo bez něj. Vzhledem k této vysoké variabilitě je pro další výzkum a pozorování počtu získaných oocytů, průběhu IVF a dosažených těhotenství tedy nejvhodnější sledovat stále tentýž (oocyt obsahující) folikul. Pouze pokud to není možné, lze pro charakterizaci dané ženy použít medián z minimálně tří folikulů.

Abstract:

The doctoral thesis is focused on the determination of homocysteine and related thiols and vitamins in diverse body fluids of both men and women in connection with fertility disorders. Thiols which are investigated in this work (homocysteine, cysteine, cysteinylglycine and glutathione) are amino acids and peptides containing the sulfhydryl group. These compounds are important to maintain the redox homeostasis and antioxidative defence of an organism. They are also considerable intermediates and precursors of many metabolic pathways. The disturbances of thiols metabolism are connected with oxidative stress and increased risk of many pathological states including the fertility disorders. The excessive production of free radicals causes injuries of plasma membranes and DNA of cells, including gametes. That way, these processes result in the deterioration of sperm and oocyte function. The aim of the thesis was to develop the analytical method and to determine the concentrations of homocysteine and related thiols and also concentrations of vitamin B12 and folic acid in seminal fluid and spermatozoa and to identify the relationships between them and spermiogram parameters and the degree of sperm DNA injury. Another objective was to determine the concentrations in blood plasma and follicular fluid in women, observe their changes during ovarian stimulation and the differences between follicles with and without oocytes and also identify the intraindividual variability of thiol concentrations in particular follicles of the given woman. All determinations and clinical studies were performed on the body fluids samples acquired from the clients of Center of assisted reproduction, Faculty Hospital in Brno. The method of HPLC with fluorescence detection used at Department of Biochemistry, MU Brno was used for the detection of thiols in blood plasma and follicular fluid. New HPLC procedure was developed and optimalized for the detection of thiols in seminal fluid and spermatozoa. This new method is characterised by CV value of 1,78 % for seminal fluid and CV value of 1,58 %, bias value of 0,82 % and TE of 0,12 mol/l for standard solution of 3,125 mol/l homocysteine. A new method of sperm lysis and obtention of their intracellular content was developed by resuspendation of spermatozoa in 80 % methanol, incubation and fivefold freezing and melting in ultrasound bath. In some patients, DNA injury was observed, using the microelectroforetic method of comet analysis. The concentration of folates and vitamin B12 in seminal fluid and blood serum was assesed at the Department of Clinical Biochemistry and Haematology, Faculty Hospital in Brno by use of electrochemiluminiscence immuno-assay. The measured intracellular concentrations of thiols in sperms are three to five orders of magnitude higher than published values. The supposed reason is effective sperm lysis and obtention of complete intracellular content. Statistically significant differences in the concentrations of vitamins and thiols in seminal fluid between particular patient groups according to the result of spermiogram evaluation and significant correlations between spermiogram parameters and concentrations of vitamins and thiols in seminal fluid and sperms were found. Especially obvious are the negative correlations between the sperm concentration and intracellular concentrations of thiols and the dependance of the degree of sperm movement on intracellular concentration of thiols with a hint of a similar trend in seminal fluid. The concentration of cysteine and homocysteine in sperms correlates with their concentration in seminal fluid. None correlation was observed in blood plasma, this determination is apparently no important for the male fertility investigation. Significantly lower degree of sperm DNA integrity damage in normospermia than in patients with spermiogram disorders was detected. Also the influence of supraphysiological concentrations of homocysteine in ejaculate on the

Abstract:

sperm DNA integrity was observed, statistically significant in normospermia. All these findings show evidence of an important effect of thiols on the quality of spermiogram and thus the fertilization capability. The decrease of blood concentrations of thiols during ovarian stimulation by FSH was confirmed. Statistically significant differences between cysteine and glutathione concentrations in follicles with and without oocytes were found. The concentration of homocysteine and cysteinylglycine were higher in follicles without oocyte, but the differences were not statistically significant. The main finding in women is the very high intraindividual variability in follicular concentrations of all thiols, regardless they contained an oocyte or not. Considering this high variability, the best for further research and surveillance of number of obtained oocytes, IVF course and clinical gravidities is to observe one and the same oocyte containing follicle. Only when this is not possible, the median value from minimally three follicles can be used for the characterization of the given woman.

Klíčová slova

homocystein, cystein, cysteinylglycin, glutathion, thioly, spermie, seminální tekutina, ovariální stimulace, folikulární tekutina, neplodnost, IVF, homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, glutathione, thiols, sperm, seminal fluid, ovarian stimulation, follicular fluid, infertility, HPLC

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 7. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 10. 2011
• Vedoucí: prof. RNDr. Eva Táborská, CSc.

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská chemie a biochemie (čtyřleté) / Lékařská chemie a biochemie