Uchování savčích oocytů v komerčních médiích pro manipulaci s embryi

Bc. Petra Vedralová

Master's thesis

Holding of mammalian oocytes in commercial embryo holding medium.

Abstract:

Cílem této práce bylo ověřit hypotézu, že si savčí oocyty zachovají vývojovou kompetenci i po uchování v 17°C v manipulačním médiu pro embrya. Pro experiment byly použity vaječníky, které byly získány od pohlavně dospělých krav a prepubertálních prasniček poražených na lokálních jatkách. Po jejich převozu byly aspirovány oocyty z preantrálních folikulů. Zatímco první skupina oocytů byla kultivována ihned po aspiraci (kontrolní skupina), druhá skupina oocytů byla nejdříve ponechána po dobu 18-24 hodin v termoboxu při 17°C v 1 ml BoviHold médiu (holding medium pro bovinní embrya) a poté byly oocyty kultivovány (experimentální skupina). Kultivace oocytů vždy proběhla v inkubátoru při 38,2°C, 5% obsahu CO2 a 95% vlhkosti. U bovinních oocytů inkubace trvala 24 h a u prasečích 48 hodin.V první části experimentu bylo u oocytů hodnoceno jaderné zrání s použitím Vectashield Antifade Mounting Medium s DAPI, kdy se stanovovalo procentuální zastoupení oocytů ve stádiu zárodečného váčku, metafáze I a metafáze II. V druhé části experimentu se u oocytů po vyhodnocení jaderného zrání detekovaly buněčné formy reaktivního kyslíku (ROS) s použitím DCFDA (H2DCFDA (2’,7’ – dichlorofluorescin diacetate)) na základě intenzity fluorescence. V obou skupinách hodnocených prasečích oocytů dozrálo do stádia metafáze II 86,7 % oocytů. Bovinní oocyty uchované v BoviHold médiu dosáhly druhé metafáze v 90,3 %, což bylo ještě asi o 5 % více než ve skupině kontrolní. Mezi hodnocenými skupinami nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl (P > 0,05). V případě hodnocení ROS v experimentální skupině prasečích oocytů byla oproti kontrolní skupině naměřena průměrná intenzita fluorescence o 55 % vyšší, u bovinních oocytů v experimentální skupině byl oproti kontrolní skupině zjištěn nárůst intenzity fluorescence o 35 %. Experimentem byl tedy u oocytů zjištěn statisticky významný rozdíl v průměrné intenzitě fluorescence (P < 0,05) mezi kontrolními a experimentálními skupinami prasečích a bovinních oocytů. Avšak při vzájemném porovnávání experimentálních skupin u prasečích a bovinních oocytů nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl v relativní intenzitě fluorescence (P > 0,05). U obou druhů byla v experimentálních skupinách naměřena vyšší relativní průměrná intenzita. Tím se potvrdilo tvrzení, že čím déle bude s oocyty manipulováno v in vitro podmínkách, tím budou hladiny ROS narůstat.Experimentem bylo prokázáno, že prasečí i bovinní oocyty byly i po několikahodinovém skladování za snížených teplot stále životaschopné a dozrávaly do metafáze II. Také bylo zjištěno, že skladování oocytů v holding médiu, zvyšuje hladinu ROS v cytoplazmě. Jako další postup v této oblasti in vitro produkce embryí lze doporučit experimenty týkající se in vitro fertilizace takto skladovaných oocytů, čímž lze odpovědět na otázku, zda se mohou tyto oocyty vyvinout do stádia blastocysty.

Abstract:

The aim of this work was to verify the hypothesis that mammalian oocytes retain developmental competence even after storage at 17 ° C in embryo manipulation medium. The ovaries were used for the experiment, which were obtained from sexually mature cows and prepubertal gilts slaughtered in local slaughterhouses. Oocytes from preantral follicles were aspirated after their transport. While the first group of oocytes was cultivated immediately after aspiration (control group), the second group of oocytes was first left for 18-24 hours in a thermobox at 17 ° C in 1 ml of BoviHold media (holding medium for bovine embryos) and then the oocytes were cultured experimental group). Oocyte culture was always incubated at 38.2 ° C, 5% CO2 and 95% humidity. Bovine oocytes were incubated for 24 hours and for pigs 48 hours.In the first part of the experiment, nuclear maturation was evaluated for oocytes using the Vectashield Antifade Mounting Medium with DAPI, where the percentage of oocytes in the stage of the embryo, metaphase I and metaphase II was determined. In the second part of the experiment, the reactive oxygen cellular forms (ROS) using DCFDA (H2DCFDA (2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetate)) were detected in oocytes after evaluation of nuclear maturation based on the fluorescence intensity. In both groups of evaluated pig oocytes, 86.7% of the oocytes matured into the metaphase II stage. Bovine oocytes retained in BoviHold medium reached the second metaphase at 90.3%, which was still about 5% more than in the control group. No statistically significant difference (P> 0.05) was found between the groups evaluated.In the case of the ROS evaluation in the experimental group of pig oocytes, the mean fluorescence intensity was 55% higher than that of the control group, the bovine oocytes in the experimental group showed an increase in fluorescence by 35% compared to the control group. Thus, the oocyte found a statistically significant difference in mean fluorescence intensity (P <0.05) between control and experimental groups of pig and bovine oocytes. However, in the comparison of experimental groups in pigs and bovine oocytes, no statistically significant difference in relative fluorescence intensity (P> 0.05) was found. For both species, higher relative mean intensity was measured in the experimental groups. This confirms the claim that the longer the oocytes will be manipulated in in vitro conditions, the ROS levels will increase.The experiment has shown that both porcine and bovine oocytes were still viable after several hours of storage under reduced temperatures and matured in metaphase II. It has also been found that the storage of oocytes in the holding medium increases the level of ROS in the cytoplasm. As a further step in this field of in vitro embryo production, experiments concerning in vitro fertilization of oocytes stored in this way can be recommended to answer the question of whether these oocytes can develop into blastocysts.

Keywords

folikul, in vitro zrání, oocyt, aspirace

Keywords

aspiration, follicle, in vitro maturation, oocyte

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology