Příprava mutantů Medicago sativa se sníženou expresí genu MMK2

Kateřina POLLÁKOVÁ

Bachelor's thesis

Preparation of Medicago sativa mutant lines with reduced MMK2 gene expression

Abstract:

Medicago sativa, mezinárodně známa jako alfalfa, je jednou z hospodářsky významných plodin pěstovaných po celém světě především jako krmná rostlina. V poslední době se využívá v laboratořích jako předmět studia za účelem přípravy odolnějších kultivarů, které by lépe snášely nepříznivé podmínky prostředí, které jsou hlavním limitujícím faktorem zodpovědným za ztráty v zemědělství. Pochopení, jakým způsobem rostliny přijímají a rozpoznávají podněty z prostředí, je důležitým krokem při přípravě rostlin s vylepšenými vlastnostmi. Hlavním předmětem zájmu této práce je protein MMK2, který spadá do rodiny mitogenem aktivovaných protein kináz. Tato konkrétní kináza je součástí kaskád aktivovaných environmentálním stresem, jako je stres z těžkých kovů, ze sucha či biotický stres. Cílem této práce je příprava mutantů M. sativa se sníženou expresí genu MMK2, což by otevřelo dveře dalším studiím cíleným na pochopení funkce této MAP-kinázy. Pomocí Gateway klonovací technologie byly připraveny rekombinantní plazmidy nesoucí konstrukt pro expresi krátkých vlásenkových RNA, které v rostlinných buňkách procesem RNA interference zajistí štěpení mRNA kódující protein MMK2 a tím sníží jeho expresi. Divoký typ M. sativa a nadexpresní linie AtUBQ10::GFP:cMMK2 a 35S::GFP:cMMK2 byly transformovány připravenými RNAi konstrukty, regenerovány procesem somatické embryogeneze a ověřeny genotypizací metodou PCR.

Abstract:

Medicago sativa, internationally known as alfalfa, is one of the main agricultural plants used all over the world as a feed crop. In the last years, alfalfa has been used as a plant of interest to prepare cultivars resistant to unfavourable environmental conditions, a limiting factor affecting crop yield. In order to improve the qualities of various plant species including alfalfa, it is important to understand the way how plants respond to environmental stimuli, especially signal perception and recognition, inducing an appropriate response on a cellular level. The main interest of this thesis is the protein MMK2, belonging to the family of mitogen-activated protein kinases. This particular MAP-kinase is a part of signaling cascades involved in response to environmental stress, such as heavy metal stress, drought stress, and biotic stress. The aim of this thesis is to prepare M. sativa mutant lines with reduced expression of the MMK2 gene, which will enable further studies of this MAP-kinase to be performed. Using a Gateway cloning technology, two recombinant plasmids were prepared, carrying constructs for the expression of short hairpin RNAs, which interfere with mRNA coding the MMK2 protein via RNA interference, resulting in cleavage of the coding mRNA, thus reducing expression of the MMK2 protein. M. sativa Wild type and two overexpression lines AtUBQ10::GFP:cMMK2 and 35S::GFP:cMMK2 were transformed with prepared constructs, regenerated by somatic embryogenesis, and tested by genotyping with PCR.

Keywords

Medicago sativa L., MMK2, MAP-kináza, RNAi, umlčování genů, gateway klonování

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dominik Novák, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biotechnology and Genetic Engineering / Biotechnology and Genetic Engineering