Nespecifické imunitní mechanismy ryb

Mgr. Soňa Tolarová, Ph.D.

Doctoral thesis

Fish nonspecific immune parameters

Abstract:

Imunitní systém ryb stejně jako savců můžeme rozlišit na část nespecifickou a specifickou. Nespecifické imunitní mechanismy zahrnují fagocytózu, aktivaci komplementového systému a antibakteriálních faktorů, zatímco mechanismy specifické imunity jsou založeny na stimulaci lymfocytů a produkci specifických protilátek. Ryby jako poikilotermní živočichové jsou ovlivněny prostředím v němž žijí. Toto prostředí se neustále mění působením abiotických (např. teplota vody, fotoperioda) a biotických faktorů (např. patogeny, paraziti) a ovlivňuje tak metabolické procesy zahrnující imunitní odpověď, reprodukci, výživu, chování a míru stresu. Součástí metodické části disertační práce je i optimalizace metody stanovení bakteriolytické aktivity komplementového systému. Optimalizace byla provedena se vzorky kapřího a lidského séra. Stanovena byla celková aktivita komplementu (TA), která zahrnuje všechny tři cesty aktivace a aktivita pouze alternativní cesty (AP). Jako nejvhodnější teplota pro stanovení aktivity TA u ryb je 20-25°C, tedy laboratorní teplota a pro stanovení aktivity AP 37°C. U člověka byla stanovena jako nejvhodnější teplota 37°C pro TA i AP. Dále jsme testovali jaký nejnižší objem v reakční jamce lze použít pro dosažení adekvátní odpovědi komplementu a zjistili jsme, že nejnižší možný objem je 50μl pro TA i AP. Vliv použitého pufru na výsledek měření není až tak závažný, lze použít jak HBSS (Hank´s balanced salt solution) tak PBS (phosphate buffered salt) pufr. Studie č. 1 sleduje zejména vliv faktorů vnějšího prostředí na mechanismy nespecifické imunity kapra obecného (Cyprinus carpio). Pro stanovení aktivity respiračního vzplanutí fagocytů v plné krvi byla použita luminolem zesílená chemilunimiscenční metoda. Byla zjištěna pozitivní korelace mezi aktivitou RB (respiratory burst) a počtem fagocytů a negativní korelace mezi aktivitou RB a teplotou vody. Nejvyšší aktivita RB byla naměřena v chladném období roku. Bakteriolytická aktivita komplementu byla stanovena bioluminiscenční metodou využívající rekombinantní bakteriální kmen E. coli. Byla měřena aktivita TA i AP. Nejvyšší aktivita TA byla zaznamenána na podzim a nejnižší na jaře. Oproti tomu AP dosáhla nejvyšší aktivity na jaře a nejnižší v zimě a v létě. Rozdíly v aktivitě TA a AP naznačují, že každá z těchto drah má odlišnou roli v jednotlivých sezónních obdobích. Hladina 11-ketotestosteronu byla analyzována v plasmě samců za účelem zhodnocení vlivu tohoto hormonu na měřené parametry ryb. Negativní korelace byla prokázána mezi 11-ketotestosteronem a RB a aktivitou TA komplementu. Vrámci studie č. 2 byl sledován vliv sezóny a úrovně ploidie na hematologické parametry a parametry nespecifické imunity lína obecného (Tinca tinca L.). Všechny měřené hematologické parametry (počet erytrocytů a leukocytů, hematokrit a koncentrace hemoglobinu) byly silně ovlivněny jak sezónou tak úrovní ploidie. Vliv pohlaví byl zaznamenán pouze u počtu leukocytů. Parametry nespecifické imunity: respirarační vzplanutí a komplement byly stanoveny stejnými metodami jako ve studii č. 1. Koncentrace lysozymu v kožním mukuse byla stanovena metodou radiální difúze v agarózovém gelu. Vliv sezóny byl zaznamenán u všech parametrů nespecifické imunity, vliv ploidie byl prokázán pouze u RB. Vliv pohlaví na aktivitu parametrů nespecifické imunity nebyl zaznamenán. Hladina glukózy jako ukazatele míry stresu byla silně ovlivněna sezónními změnami, vliv ploidie nebyl prokázán. Podobný výsledek byl zaznamenán také u 11-ketotestosteronu v plasmě samců.

Abstract:

Similarly as in mammals fish immune system is divided into non-specific and specific parts. The non-specific immune mechanisms include phagocytosis, complement system and antibacterial factors, whereas the specific immune mechanisms include stimulated lymphocytes and antiboby production. Fish as they are poikilothermic are strongly influenced by environment they live in. This environment is constantly affected by abiotic (e.g. water temperature, photoperiod) and biotic factors (e.g. pathogens, parazites) and influences all metabolic processes, including the immune response, reproduction, nutrition, behaviour and level of stress. The methodical part of dissertation thesis includes optimalization of bioluminescence-based method of complement activity. The optimalization was performed with carp and human sera samples. The total complement activity (TA) (comprises of all three pathways) and alternative pathway (AP) were determined. In fish, the optimal assay temperature for TA was 20-25°C, thus laboratory temperature and for AP 37°C. In human, the optimal temperature was 37°C for both TA and AP. Further, we tested, what the lowest volume in reaction well was to get sufficient response of complement. The lowest possible volume was determined 50μl for both TA and AP. We tested also type of the buffer used in complement assay and we are able to say, that both HBSS (Hank´s balanced salt solution) and PBS (phosphate buffered salt) are suitable for assay. The study no. 1 focuses on effect of environmental factors influencing non-specific immune mechanisms in common carp (Cyprinus carpio). The luminol-enhanced chemiluminescence method was used to determine respiratory burst activity in whole fish blood. Positive correlation was found between RB activity and phagocyte number and negative correlation was found between RB activity and and water temperature. The highest activity of RB was measured during the coldest period within a year. Bioluminescence-based method was used to determine the total bacteriolytic activity (TA) and the activity of alternative pathway (AP). This method uses recombinant bacterial strain of E. coli. The highest activity of TA was determined in autumn and the lowest in spring. Activity of AP reached the highest activity in spring and the lowest in summer. Variations in TA and AP activity suggest that each of these pathways plays different role in particular season. The level of 11-ketotestosterone was analysed in male plasma samples to evaluate the effect of this steroid hormone on measured parameters in fish. The negative correlation was found between 11-KT, RB and complement TA. The study no. 2 analysed the effect of fish ploidy level and seasonality on haematological parameters and innate immune response of tench (Tinca tinca L.). All the measured haematological parameters (erythrocyte and leukocyte count, haematocrit, haemoglobin concentration) were strongly affected by the season and fish ploidy status. The effect of sex was found only in leukocyte count. The same methods were used to determine non-specific immune parameters: respiratory burst and complement. Radial difusion in agarose gel was used to determine lysozyme concentration in skin mucus. All the innate immunity parameters were influenced by season, the effect of ploidy was documented only in RB. No effect of sex on innate immunity was observed. The level of stress measured as glucose concentration showed seasonal changes, no effect of ploidy was found. The same trend was also observed for 11-ketotestosterone in males.

Keywords

nespecifické imunitní parametry, respirační vzplanutí, komplement, lysozym, sezónní změny, kaprovité ryby

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 7. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 9. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
• Reader: doc. MVDr. Miroslava Palíková, Ph.D., MVDr. Veronika Piačková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology