Využití in vitro metody regenerace obilnin a selekce genů pro transformaci ke zlepšení rezistence vůči viru zakrslosti pšenice

RNDr. Pavel Cejnar

Doctoral thesis

In vitro methods for the regeneration of cereals and selection of genes for transformation to improve resistance to Wheat dwarf virus

Abstract:

Disertační práce shrnuje současné poznatky o viru zakrslosti pšenice (WDV) – jeho význam, rozšíření, známé hostitelské druhy, životní cyklus viru. Podrobně dále rozebírá molekulárně genetické aspekty přenosu viru a funkci jednotlivých virových proteinů. Z experimentálních výsledků práce popisuje připravené transgenní rostliny obilnin s vneseným konstruktem WDVRepA215, odvozeným od sekvence virového replikačního proteinu, a rostliny s konstruktem WDVRepA215RBRmut, zahrnujícím cílenou dvoubodovou mutaci domény pRBR. U rostlin s přítomnou dvoubodovou mutací bylo pozorováno významné zpoždění nárůstu titru viru WDV jako pravděpodobný následek narušení mechanismu infekce v rostlinách. Dále práce uvádí přípravu infekčních klonů viru WDV v plasmidech pUC18 a pIPKb002. Pomocí těchto infekčních klonů byl ověřen experimentální přenos viru na rostlinu za použití agroinokulace a biolistické inokulace bez nutné přítomnosti hmyzího přenašeče. Rovněž je popsán optimalizovaný extrakční protokol nukleových kyselin z obilnin tak, aby bylo možné na jednotlivých rostlinách sledovat časový průběh infekce WDV na molekulární úrovni po dobu několika týdnů. Obdobně, pro virové proteiny, je prezentován optimalizovaný extrakční protokol pro extrakci proteinů z jednotlivých listů rostlin umožňující přímou detekci virových proteinů za použití techniky LC-MS/MS a potvrzení přítomnosti virových proteinů bez nutnosti nenávratného zničení sledované rostliny. Univerzálnost protokolu je dále demonstrována i na dalších hospodářsky významných rostlinách s různými virovými infekcemi.

Abstract:

The dissertation thesis summarizes the current knowledge about the Wheat dwarf virus (WDV) - its importance, distribution, known host species, and life cycle of the virus. It further discusses in detail the molecular genetic aspects of virus transmission and the function of each viral protein. From the experimental results, the work describes transgenic cereal plants with the introduced WDVRepA215 construct, derived from the viral replication-protein sequence, and plants with the WDVRepA215RBRmut construct, with an additional two-point mutation of the pRBR domain. In plants with a two-point mutation present, a significant delay in the increase in WDV titer was observed as a probable consequence of disruption of the mechanism of infection in the plants. Furthermore, the work presents the infectious WDV virus clones constructed in plasmids pUC18 and pIPKb002. Experimental transmission of the virus to the plant was verified using these infectious clones using agroinoculation and biolistic inoculation without the necessary presence of an insect vector. An optimized extraction protocol for nucleic acids from cereals is also described, so that it is possible to monitor the time course of WDV infection at the molecular level for several weeks on individual plants. Similarly, for viral proteins, an optimized extraction protocol for protein extraction from individual plant leaves is presented, allowing direct detection of viral proteins using LC-MS/MS and confirmation of the presence of viral proteins without the need for irreversible destruction of the plant. The universality of the protocol is further demonstrated on other economically important plants with various viral infections.

Keywords

virus zakrslosti pšenice, rezistence obilnin, infekční klon, detekce viru, LC-MS/MS

Keywords

pathogen-derived resistance, infectious clone, virus detection, LC-MS/MS, Wheat dwarf virus

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Agricultural Specialization / Agricultural and Forestry Phytopathology and Plant Protection