Izolácia mikroorganizmov z včelieho tráviaceho traktu a overenie ich kultivačných a technologických vlastností

Bc. Daniel Svatík

Diplomová práce

Isolation of bacteria from honey bee digestive tract and evaluation of their technological and cultivation properties

Abstract:

Thanks to the pollination activity bees are undoubtedly one of the essential components of modern, diverse and more ecological agriculture and at the same time an amazing superorganism with a characteristic bacterial population. We believe that it is the modulation of bacterial conditions in bees that could support their immunity in the fight against pathogens and diseases and improve the efficiency of the bee family. The aim of our work was to isolate range of bacteria from lactobacilli and bifidobacteria from the bee digestive tract, which are most often associated with a positive effect on the host. Next, verify the culture properties of bacteria in whey medium and prepare a bacterial lyophilisate with defined bacterial cell viability. We extracted entire digestive tract of six bees from each location, and after culturing the diluted homogenate, we isolated pure bacterial colonies. Out of 95 isolates, 35 of them were identified by comparative analysis of the 16S rRNA gene. We isolated almost the entire bee "core microbiome" (Kwong and Moran 2016) and optimized the whey medium so that the bacteria were able to multiply and at the same time the bacterial lyophilisate pellet contained a minimum amount of residual lactose that is toxic to bees (Sylvester 1979). In selected 7 strains (Lactobacillus kimbladii (KT3), Bifidobacterium asteroides (P1/TP2), Bifidobacterium asteroides (D1/TP1), Bifidobacterium coryneforme (syn. Bifidobacterium indicum) (D1/TP5), Lactobacillus apis (P1/MR10), Lactobacillus. melliventris (P1/MR11) a Lactobacillus. helsinborgensis (KR10)) increased viable cells by at least 2 orders over 48 hours. Biggest increase, almost 4 orders, was recorded for L. kimbladii (KT3). After fermentation, the media was subjected to composition determination by 1H-NMR analysis, which captured changes in the concentration of substances characteristic for the fermentation processes. Finally, the ability of the isolates to survive the lyophilization process with the addition of sugar cryoprotectant was tested. A 5 % sucrose solution was chosen as the most suitable cryoprotectant. Overall the experiment provides a pilot proposal for the preparation of a bacterial lyophilisate, which will be an important part of further attempts to prepare a functional bee probiotic supplement.

Abstract:

Včely sú vďaka opeľovacej činnosti, nespochybniteľne jednou z esenciálních zložiek moderného, rozmanitého a ekologickejšieho poľnohospodársta a zároveň úžasným superorganizmom s charakteristickou bakteriálnou populáciou. Domnievame sa, že práve modulácia bakteriálnych pomerov u včiel by mohla podporiť ich imunitu v boji proti patogénom a zlepšiť efektivitu včelej rodiny. Cieľom mojej práce bolo vyizolovať z včelieho tráviaceho traktu škálu zástupcov skupiny laktobacilov a bifidobaktérii, ktoré sú najčastejšie spájané s pozitívnym vplyvom na hostiteľa, overiť kultivačné vlastnosti baktérii na srvátkovom médiú a pripraviť bakteriálny lyofilizát s definovanou životaschopnosťou bakteriálnych buniek. Zo šiestich včiel z každej lokality bol extrahovaný celý tráviaci trakt, a po kultivácii zriedeného homogenizátu sme izolovali čisté kolónie. Z 95 izolátov sa pomocou komparatívnej analýzy 16S rRNA génu podarilo identifikovať 35 bakteriálnych kmeňov. Izolovali sme takmer celý včelý „core microbiome“ (Kwong a Moran 2016) a optimalizovali srvátkovémo médium, tak, aby boli baktérie schopné množiť sa a zároveň, aby peleta bakteriálneho lyofilizátu obsahovalo minimálne množstvo reziduálnej laktózy, ktorá je pre včely toxická (Sylvester 1979). Pri vybraných 7 kmeňoch (Lactobacillus kimbladii (KT3), Bifidobacterium asteroides (P1/TP2), Bifidobacterium asteroides (D1/TP1), Bifidobacterium coryneforme (syn. Bifidobacterium indicum) (D1/TP5), Lactobacillus apis (P1/MR10), Lactobacillus. melliventris (P1/MR11) a Lactobacillus. helsinborgensis (KR10)) bolo počas 48 hodín v srvátkovom médiu zaznamenané zvýšenie množstva životaschopných buniek o minimálne 2 rády. Najviac však o 4 rády pri druhu L. kimbladii (KT3). Médiá boli po fermentácii podrobené stanoveniu zloženia pomoccou 1H-NMR analýzy, ktorá zachytila zmeny koncentrácii látok charakteristických pre fermentačné procesy. Nakoniec bola testovaná schopnost izolátov prežívať proces lyofilizácie s prídavkom cukorného kryoprotektantu. Ako najvhodneší kryopretektant bol zvolený 5% roztok sacharózy. Experiment prináša pilotný návrh prípravy bakteriálneho lyofilizátu, ktorý bude dôležitou súčasťou ďaľších pokusov na pŕipravu funkčného včelieho probiotického doplnku.

Keywords

honeybee probiotics, bacteria lyophilisation, cultivation, whey, core microbiome

Klíčová slova

lyofilizácia baktérii, kultivácia, srvátka, včelie probiotiká, core microbiome

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Jaroslav Havlík, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program:
Kvalita potravin a zpracování zemědělských produktů