Stanovení homocysteinu v tělních tekutinách metodou HPLC a jeho vliv na lidskou reprodukci

Bc. Martina Vodová

Master's thesis

The determination of homocysteine in the body fluids using HPLC method and its impact on the human reproduction

Abstract:

Zvýšená hladina homocysteinu, hyperhomocysteinemie, je všeobecně přijímána jako významný rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění. Ovlivňuje však negativně mnoho dalších oblastí lidského zdraví, včetně procesů, které úzce souvisí s plodností mužů a žen. V teoretické části diplomové práce byly popsány vlastnosti a metabolismus molekuly homocysteinu. Dále byly shrnuty dosavadní znalosti o toxických účincích homocysteinu, především pak jeho vliv na mužský a ženský reprodukční systém. V závěru této části jsou stručně popsány analytické metody pro stanovení koncentrace homocysteinu a v krátkosti je také představena kometová analýza. V experimentální části byla stanovována koncentrace homocysteinu pomocí HPLC-FD v krevní plazmě, folikulární a seminální tekutině a ve spermiích pacientů, kteří se učastnili metod asistované reprodukce. Pro stanovení koncentrace homocysteinu v intracelulárním obsahu spermií byla zavedena a optimalizována metoda rozbíjení spermií destilovanou vodou. Dále byla optimalizována metoda kometové analýzy pro stanovení míry poškození DNA ve spermiích. Pomocí této metody byl potvrzen negativní vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií. U žen byl potvrzen pokles hladiny homocysteinu v krvi po ovariální stimulaci FSH a zjištěná velká intraindividuální variabilita v koncentracích thiolů mezi jednotlivými folikuly jak s oocytem, tak bez oocytu. Souvislost koncentrace homocysteinu v seminální tekutině se spermiologickými hodnotami mužů nebyla potvrzena, stejně jako souvislost koncentrace intracelulárního homocysteinu ve spermiích s mírou poškození jejich DNA.

Abstract:

Increased concentration of homocysteine called hyperhomocysteinemia is commonly accepted as important risk factor for cardiovascular diseases. However, it negatively affects many other areas of human health, including processes that are closely related to fertility of men and women. The properties and metabolism of homocysteine molecule were described in the theoretical part of this work. The current knowledge about toxic effects of homocysteine, especially its impact on male and female reproductive system was summarized. Analytical methods for determination of homocysteine were described and also comet assay was introduced at the end of this part. Concentration of homocysteine in blood plasma, follicular and seminal fluid and intracellularly in sperm of patients was determined using HPLC-FD in the experimental part. A new method for breaking sperm using distilled water was introduced and optimalized for determination of homocysteine in intracellular fluid of sperm. Further, the method of comet assay for detection of DNA damage in sperm was optimalized. Using this method, the negative effect of oxidative stress on DNA damage of sperm was shown. Decrease of homocysteine level in blood plasma following ovarial stimulation with FSH was confirmed. High intraindividual variability in thiol concentrations between different follicules with as well as without oocyte was found. The relation between homocysteine concentration in seminal fluid with spermiogram values was not confirmed. Also concentration of intracellular homocysteine did not correlate with level of their DNA damage.

Keywords

homocystein, hyperhomocysteinemie, lidská reprodukce, spermie, vajíčka, těhotenství, folikulární a seminální tekutina, kometová analýza, poškození DNA, homocysteine, human reproduction, sperm, oocyte, pregnancy, follicular and seminal fluid, comet assay, DNA damage

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2010
• Supervisor: Ing. Jitka Melounová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry