Příprava mutant citlivých k polyvalentnímu fágu 812 u kmenů S. aureus pomocí transpozonové mutageneze

Bc. Pavel Vrána

Master's thesis

Preparation of S. aureus mutant strains sensitive to polyvalent phage 812 by means of transposon mutagenesis

Abstract:

Staphylococcus aureus je významným lidským a zvířecím patogenem. Kmeny tohoto druhu byly původně citlivé prakticky ke všem antibiotikům, díky horizontálnímu přenosu genů však postupně získaly celou řadu genů rezistence. V současné době představují celosvětový zdravotnický problém zejména meticilin-rezistentní klony, které jsou velmi často multirezistentní. Selhávání antibiotické terapie vede k hledání nových způsobů léčby infekcí způsobených těmito multirezistentními patogeny. Možnou alternativou je fágová terapie, která spočívá ve využití bakteriofágů. Jedním z nich je polyvalentním fág 812, který lyzuje až 95% kmenů S. aureus, avšak výskyt kmenů rezistentních k tomuto fágu snižuje efektivitu fágové terapie. Mechanismy rezistence k fágu 812 dosud nejsou známy. Cílem práce bylo s využitím transpozonové mutageneze připravit citlivé mutanty kmenů S.aureus z rezistentních klonů a identifikovat tak geny zodpovědné za rezistenci k polyvalentním fágům. Byla vypracována metoda přenosu transpozonu Tn917 lokalizovaného na plazmidu pTV1ts do buněk S. aureus pomocí elektroporace a zároveň byly optimalizovány podmínky selekce bakteriálních buněk obsahujících transpozon začleněných v genomu buněk S. aureus. Začlenění transpozonu do genomu a ztráta doručovacího vektoru byla prokázána PCR navrženou pro detekci plazmidu a transpozonu. Celkem bylo analyzováno 19862 kolonií na citlivost k fágu 812. Během řešení diplomové práce se však zatím nepodařilo izolovat žádnou mutantu citlivou k fágu 812. Hlavním přínosem DP je zavedení této nové metody na pracovišti LMDM, která bude u S. aureus využívána k přípravě mutant v různých znacích.

Abstract:

Staphylococcus aureus is an important human and animal pathogen. Originally sensitive to almost all antibiotics but due to horizontal gene transfer numerous resistance genes were acquired . Especially methicillin - resistant clones , which are often multiresistant, represent a global healthcare problem. Failure of antibiotic therapy leads to discovery of alternative treatments for infections caused by this multidrug-resistant pathogen. One possible alternative is phage therapy , which involves the use of bacteriophages . Polyvalent phage 812 lyses up to 95% of S. aureus strains , but the occurrence of phage-resistant clones reduces the effectivity of its therapeutical usage . The mechanisms of resistance to phage 812 are not yet known. The aim of this work was to prepare sensitive mutant strains of S. aureus resistant clones by means of transposon mutagenesis and thus identify genes responsible for resistance to polyvalent phages. Method of transposon Tn917 transmission localized on the plasmid pTV1ts to S. aureus cells by electroporation was developed. Conditions for the selection of bacterial cells containing the transposon integrated in the genome of S. aureus cells were optimised . Integration of the transposon into the genome and loss of the delivery vector was demonstrated by PCR designed to detect plasmid and transposon. Total number of 19862 colonies were analyzed for sensitivity to phage 812 but none of them exhibited changed sensitivity. This work main benefit is the introduction of this new method to the Laboratory of Molecular Diagnostic of Microorganisms where it can be used to prepare mutants of S.aureus in various characters.

Keywords

Staphylococcus aureus, MRSA, fág 812, mechanismy rezistence, transpozony, mutageneze, phage 812, mechanisms of resistance, transposons, mutagenesis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2014
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology