In vitro kultivace zárodečných kmenových buněk jesetera

MSc. Xuan XIE

Doctoral thesis

In vitro culture of sturgeon germ stem cells

Abstract:

The study in this thesis concerns a research area related to sturgeon germ cell biology including identification, purification and in vitro culture. The research objectives are: expounding fish spermatogonial stem cell characteristic and regulation of spermatogenesis; evaluation of the existent methods in fish germ cell purification and in vitro culture; investigation of in vitro amplification of sturgeon germ cells; development of an approach to purify germ cells in sturgeon; identification of type A spermatogonia (ASG) in sturgeon. Novelty and scientific originality. This work first time developed sturgeon germ cell growth in vitro and combined cell culture with transplantation. The application of monoclonal antibodies on recognition of sturgeon ASG represents a new, and currently only tool of germ cell identification. Important scientific problem solved in the field of research. This work of germ cell culture observed the effect of somatic cells and growth factors on the proliferation of sturgeon germ cells through evaluation of germ cell mitotic activity during culture, which contributed to the study on the regulation mechanism of germ cell self-renewal and differentiation. This thesis also developed a method using flow cytometry to purify sturgeon ASGs. A monoclonal antibody was also found that enable to identify ASGs of sturgeon specifically. Theoretical significance and applied value of the thesis. The thesis summarized the accumulated knowledge of spermatogonial stem cell and regulation of its self-renewal vs. differentiation in fish, compared available protocols and advances in enriching spermatogonia and reviewed development of in vitro germ cell culture conditions. The work of efficient enrichment of type A spermatogonia was achieved based on its physicochemical properties, which is applicable for commercial and endangered fishes without cell-labeling systems such as transgenes and cell antibodies. Monoclonal antibodies generated from Pacific blue fin tuna can also recognize antigens from sterlet ASGs, indicating some epitopes for ASGs are conserved between species. The research results present interest for characterization of ASGs in proteomics level. Implementation of scientific results. A serum-free culture condition for sturgeon germ cells was established. The germ cells under this in vitro condition can remain growth, survival and maintain their transplantability for more than 40 days. Therefore, this method is expected to provide a long term supply for germ cell transplantation and surrogate production. Moreover, based on the analysis of germ cell light scatter properties, a purified ASG population was isolated. No dye and transgenes are introduced during sorting, which is helpful for characterization of germ cell populations and downstream germ cell manipulation. The application of monoclonal antibody on sturgeon ASG can achieve the accuracy of the ASGs identification on in vitro culture.

Abstract:

Tato studie se zabývá výzkumem biologie zárodečných buněk jesetera, včetně jejich charakterizace, purifikace a in vitro kultivace. Výzkumné cíle jsou: popis vlastností spermatogoniálních kmenových buněk a regulace spermatogeneze; hodnocení stávajících metod purifikace a in vitro kultivace zárodečných kmenových buněk ryb; výzkum in vitro množení zárodečných buněk jesetera; vývoj metody purifikace zárodečných buněk jesetera; identifikace spermatogonií typu A (ASG) u jesetera. Novost a vědecká originalita. Tato práce jako první vyvinula množení zárodečných buněk jesetera in vitro a zkombinovala buněčnou kultivaci a transplantaci. Aplikace monoklonálních protilátek a rozpoznání ASG jesetera representuje nový a v současné době jediný nástroj pro identifikaci zárodečných buněk. Důležitost řešení vědeckého problému v daném výzkumném oboru. Při práci kultivace zárodečných buněk byl pozorován efekt somatických buněk a růstových faktorů na proliferaci jeseteřích zárodečných buněk pomocí hodnocení mitotické aktivity zárodečných buněk během kultivace, která přispěla ke studiu regulačních mechanizmů sebeobnovy zárodečných buněk a jejich diferenciace. V této dizertační práci byly vyvinuty metody purifikace ASG jesetera pomocí průtokové cytometrie. Byla nalezena monoklonální protilátka umožňující specifickou identifikaci ASG jesetera. Teoretický význam a aplikační hodnota výsledků. Dizertační práce sumarizuje nahromaděné znalosti o spermatogoniálních kmenových buňkách a regulaci jejich sebeobnovení vs. diferenciace u ryb, porovnává dostupné protokoly a pokroky v izolaci spermatogonií a zhodnocuje vývoj podmínek in vitro kultivace zárodečných buněk. Efektivní izolace spermatogonií typu A bylo dosaženo na základě jejich fyzikálně-chemických vlastností, které jsou aplikovatelné pro komerční i ohrožené druhy ryb bez použití buněčných barvících systémů jako transgenoze nebo protilátky povrchu buňky. Monoklonální protilátky vytvořené pro tuňáka mohou rozpoznat také antigen ASG jesetera malého, naznačující, že epitopy pro ASG jsou mezi druhy konzervované. Tyto vědecké výsledky představují charakterizaci ASG na proteomické úrovni. Implementace vědeckých výsledků. Byly vyvinuté sérum prosté kultivační podmínky zárodečných buněk jesetera. Zárodečné buňky si v těchto in vitro podmínkách udržely růst, přežití a schopnost transplantace více než 40 dní. Předpokládá se, že tato metoda poskytne dlouhodobé zásobování zárodečných buněk k transplantacím a reprodukcí pomocí náhradních rodičů. Navíc, purifikované populace ASG byly izolovány na základě analýzy vlastností rozptylu světla zárodečných buněk. Pro sortování nebylo použito žádné barvivo ani transgenoze, což je výhodné pro další charakterizaci buněk a následné aplikace. Aplikace monoklonálních protilátek na ASG jesetera můžeme docílit přesné identifikace ASG v in vitro kulturách.

Keywords

zárodečné buňky, spermatogonie, kultura zárodečných buněk, fluorescenčně aktivované sortování buněk, monoklonální protilátka, jeseter

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery