Heterologní exprese a využití bakteriálních aryl-sulfotransferas (EC 2.8.2.1)

David Čáka

Bachelor's thesis

Heterologous expression and use of bacterial aryl sulfotransferases (EC 2.8.2.1)

Anotácia:

Sulfatace biologicky aktivních přírodních látek, které jsou součástí (zdravé) lidské stravy, je jednou z hlavních reakcí fáze II jejich biotransformace v lidském těle a může mít významný vliv na farmakokinetiku a biologickou aktivitu těchto látek. Typickými zástupci jsou např. polyfenoly, rostlinné steroidy, karotenoidy či glukosinoláty. Příprava selektivně sulfatovaných látek jako definovaných standardů přírodních metabolitů chemickou cestou je však obtížná, vhodnou alternativou je syntéza pomocí enzymů. Zatímco savčí eukaryotní sulfotranserasy využívají k sulfataci drahý a nestabilní adenosin-3′-fosfát-5′-fosfosulfát (zkráceně PAPS) jako donor sulfátu a jejich heterologní exprese je problematická, bakteriální aryl-sulfotransferasy (AST; EC 2.8.2.1) jsou robustní enzymy s širokou substrátovou specifitou využívající pro sulfataci levné donory (např. p-nitrofenyl-sulfát). Tyto enzymy lze s vysokým výtěžkem exprimovat v bakteriálních expresních systémech. Bakteriální AST jsou mnohem méně charakterizované než eukaryotní PAPS závislé sulfotransferasy. Přesto se pro biosyntézu metabolitů xenobiotik v poslední době využívají právě tyto bakteriální AST, které na rozdíl od eukaryotních nejsou závislé na PAPS. Díky své široké substrátové specifitě mají aryl-sulfotransferasy velký potenciál k využití v biotechnologických aplikacích. V rámci této práce byly heterologní expresí vyprodukovány dvě šarže arylsulfotransferasy z Desulfitobacterium hafniense v Escherichia coli BL21(DE3)pLysS, enzymy byly z buněk získány 1) jako hrubý buněčný lyzát a 2) z periplazmatického prostoru. Obě vyprodukované šarže byly následně purifikovány dvěma metodami – pomocí iontoměničové chromatografie (anex) na koloně DEAE Sephacel a pomocí metody gelové permeační chromatografie. U purifikovaných aryl-sulfotransferas byly porovnány jejich výtěžky, čistoty (pomocí SDS-PAGE), specifické aktivity (U/mg), koncentrace (mg/ml) a aktivity (U/ml) v jednotlivých fázích. Dále byly charakterizovány jejich biochemické (pH a teplotní optimum) a kinetické parametry (Michealisova konstanta a maximální rychlost).

Abstract:

Sulfation of biologically active natural substances, that are part of the (healthy) human diet is one of the main reactions of phase II biotransformation of these xenobiotics (for example polyphenols, plant steroids, carotenoids and glucosinolates) in the human body and can have significant impact on the pharmacokinetics and biological activity of these substances. However, the preparation of selectively sulfated substances as defined standards for natural metabolites by chemical means is difficult, and enzymatic synthesis is a suitable alternative. While mammalian eukaryotic sulfotransferases use expensive and unstable adenosin-3´-phosphate-5´-phosphosulfate (PAPS) as a donor for sulfation and their heterologous expression is not easy, bacterial aryl-sulfotransferases (AST, EC 2.8.2.1) are robust enzymes with wide substrate specificity utilizing inexpensive donors (for example para-nitrophenylsulfate) for sulfation. These enzymes can be expressed in high yields in bacterial expression systems. Bacterial ASTs are much less characterized than eukaryotic PAPS-dependent sulfotransferases. Nevertheless, these bacterial non PAPS-dependent ASTs are frequently used for biosynthesis of xenobiotic metabolites. Due to their wide substrate specificity, aryl-sulfotransferases have great potential for biotechnological applications.In this work, two batches of arylsulfotransferase from Desulfitobacterium hafniense were produced in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS by heterologous expression, enzymes were obtained from cells 1) as total cell lysate and 2) from the periplasmic space. Both batches produced were purified by two methods – by ionic exchange chromatography (anex) on a DEAE Sephacel column and by gel permeation chromatography. The purified sulfotransferases were compared for the yields, purity (by SDS-PAGE), specific activity (U/mg), concentration (mg/ml) and activity (U/ml). Furthermore, were compared their biochemical (pH and temperature optimum) and kinetic values (Michealis constant and maximum velocity).

Kľúčové slová

Metabolismus, sulfatace, aryl-sulfotransferasy, purifikace, Desulfitobacterium hafniense

Keywords

Metabolism, sulfation, aryl sulfotransferases, purification, Desulfitobacterium hafniense

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 7. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Jaroslav Havlík, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / odbor:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Quality of Agricultural Products