Application of Capillary Electrophoresis for Drug Metabolism Studies

Mgr. Bc. Roman Řemínek, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Cytochromy P450 tvoří superrodinu hem-thiolátových oxidoreduktas, které zprostředkovávají biotransformaci většiny běžně předepisovaných léčiv. Jelikož metabolismus významně ovlivňuje všechny ostatní farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, představuje stanovení afinity kandidátní sloučeniny k těmto enzymům neoddělitelnou součást časných fází vývoje nových léčiv. Pro testování těchto vzorků lze s výhodou využít techniku kapilární elektroforézy, jež umožňuje rychlé, vysoce účinné, plně automatizované analýzy s minimální spotřebou vzorku a dalších chemikálií. Kromě toho lze křemennou kapiláru využít nejen jako separační kolonu, ale také jako reaktor umožňující inkubaci enzymových reakcí v objemu několika desítek nanolitrů. Navzdory původním očekáváním je nutné připustit, že i přes své nepopiratelné výhody kapilární elektroforéza dosud nedokázala při vývoji nových léčiv nahradit techniky založené na kapalinové chromatografii. Mezi hlavní slabiny kapilární elektroforézy lze uvést omezenou opakovatelnost analýz, nízkou koncentrační citlivost a chybějící techniku pro míchání enzymu a reaktantů uvnitř kapiláry v rámci metod v on-line uspořádání, která by umožňovala rutinní změny ve složení reakční směsi a současně poskytovala relevantní hodnoty základních kinetických a inhibičních parametrů studovaných reakcí. V rámci vypracování předložené dizertační práce proto byly diskutovány možnosti zvýšení opakovatelnosti a koncentrační citlivosti kapilárně elektroforetických metod a způsoby míchání enzymu a reaktantů uvnitř kapilárního reaktoru. Na jejich základně bylo následně zavedeno pět metod rozšiřujících možnosti praktického využití kapilární elektroforézy při studiu metabolismu léčiv jak v off line, tak i on line uspořádání.

Abstract:

Cytochrome P450 enzymes (CYP) constitute a superfamily of hem-thiolate oxidoreductases playing a key role in a biotransformation of vast majority of the therapeutically relevant drugs. Since the metabolism has significant influence on the other pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristic of drugs, assessment of a candidate compound affinity to CYP represents an essential part of early phases of a new drug development process. Capillary electrophoresis (CE) represents a favorable technique for these screenings because it provides fast, highly efficient and fully automated analyses with a miniscule sample and other chemicals consumption. Furthermore, a fused silica capillary can be used not only as a separation column but also as a reaction chamber where enzymatic reactions can be incubated in a volume of only few tents of nanoliters. Despite of initial expectations, it is necessary to admit, that CE was not able to replace techniques based on liquid chromatography, which traditionally pass for a golden standard in a drug discovery and development. The limited method repeatability, low concentration sensitivity and lack of technique, which would simultaneously enable routine changes in reaction mixture compositions and provide relevant values of basic kinetic and inhibition parameters characterizing studied enzyme reaction, are generally accepted as a major hurdles of CE. For these reasons, presented thesis provides the discussion on the precautions enabling improvement of CE methods and ways of enzyme and reactants mixing inside the capillary microreactors. Five methods extending practical applicability of CE in drug metabolism studies in both off-line and on-line arrangement are then introduced.

Keywords

Cytochromy P450, Cytochrom P450 2C9, Diklofenak, Enzymová aktivita, Enzymová reakce, Inhibiční studie, Kapilární elektroforéza, Ketokonazol, Kinetické studie, Metabolismus léčiv, On-line metoda, Sulfafenazol Capillary electrophoresis, Cytochromes P450, Cytochrome P450 2C9, Diclofenac, Drug metabolism, Enzyme activity, Enzyme reaction, Inhibition study, Ketoconazole, Kinetic study, On line method, Sulfaphenazole

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 8. 8. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 9. 2013
• Vedoucí: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Oponent: RNDr. Václav Kašička, CSc., prof. Ing. Ivan Mikšík, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie