Optimalizace celogenomové amplifikace pro účely preimplantační genetické analýzy

Bc. Iva Procházková

Master's thesis

Optimisation of whole genome amplification for the purpose of preimplantation genetic analysis

Abstract:

Celogenomové amplifikace jsou metody, jež z malého množství DNA umožňují získat množství dostačující pro násedné analýzy s pokrytím celého genomu. Jsou využívány v různých oblastech molekulární genetiky, např. v nádorové genetice při analýze DNA jednotlivých malých subpopulací nádorových buněk, při studiu genetické informace nekultivovatelných organizmů nebo v případech, kdy je možné získat DNA pouze z několika buněk embryí pro navazující preimplantační genetické analýzy. Cílem této diplomové práce je optimalizovat metody celogenomové amplifikace DNA pro její využití v molekulárně-genetických analýzách pomocí komparativní genomové hybridizace na mikročipech a kvantitativní PCR v reálném čase. Srovnávány byly dva komerčně dostupné kity pro celogenomovou amplifikaci DNA založené na odlišném principu. Prvním byl kit „REPLI-g Single Cell Kit“ založený na izotermální amplifikaci násobným vytěsněním řetězce, druhým srovnávaným byl kit „PicoPLEX Whole Genome Amplification Kit“ založený na amplifikaci DNA při cyklickém střídání teplot. Analyzováno bylo osm vzorků DNA amplifikovaných oběma typy amplifikace z velmi malého vstupního množství DNA. Bylo zjištěno, že oba srovnávané komerčně dostupné kity pro celogenomovou amplifikaci poskytují dostatečné množství DNA pro následné analýzy. Srovnáním získaných výsledků analýz amplifikovaných vzorků DNA s neamplifikovanými však bylo zjištěno, že při amplifikaci malého vstupního množství DNA dochází ke vzniku amplifikačního zkreslení, které ovlivňuje výsledek analýz a může vést k nesprávné diagnóze. Při vzájemném srovnání bylo po amplifikaci kitem REPLI-g v následné mikročipové analýze detekováno více falešně pozitivních nebalancovaných chromozomových aberací, zatímco při použití kitu PicoPLEX bylo nalezeno více falešně negativních aberací. Ověření vybraných aberací metodou kvantitativní PCR bylo při nastavených pravidlech neúspěšné u všech analyzovaných vzorků DNA po obou typech amplifikace. Pravděpodobnou příčinou bylo zvýraznění amplifikačního zkreslení vzniklého při celogenomové amplifikaci vzorků DNA další amplifikací v průběhu kvantitativní PCR.

Abstract:

Whole-genome amplifications are methods that enable to obtain sufficient amount of DNA from small amounts of samples for ongoing analyses with whole-genome coverage. They are used in various fields of molecular genetics, e.g. in tumor genetics when analysing DNA from individual small subpopulations of tumor cells, for studies of unculturable organisms or in cases when DNA from only few embryonic cells is accessible for further preimplantation genetic analyses. The aim of this diploma thesis is to optimise methods of whole-genome amplification of DNA for the purpose of molecular genetic analyses by array comparative genomic hybridization and quantitative real-time PCR. Two commercially available kits for whole-genome amplification based on a different principle were compared. The first was the REPLI-g Sigle Cell Kit based on isothermal multiple displacement amplification, the second compared kit was the PicoPLEX Whole Genome Amplification Kit based on thermal cycling during DNA amplification. Eight DNA samples amplified by both methods from minute input amount of DNA were analyzed. It was found that sufficient amount of DNA for subsequent analyses is provided by both commercially available whole-genome amplification kits compared in the study. When the results of analyses of the amplified DNA samples were compared with the unamplified samples, it was determined that amplification bias is produced during amplification of minute amount of DNA, which affects the result of analyses and may lead to misdiagnosis. When comparing the two kits, after DNA amplification by the REPLI-g kit more false positive unbalanced chromosomal aberrations were detected in following microarray analysis, whereas when the PicoPLEX kit was used, more false negative aberrations were found. None of the selected aberrations could be confirmed by quantitative PCR in the samples amplified by both kits considering the determined rules. The probable cause was the amplification bias produced during whole-genome amplification which was accented by further amplification of the DNA samples during quantitative PCR.

Keywords

preimplantační genetická analýza, celogenomová amplifikace, komparativní genomová hybridizace na mikročipech, amplifikace násobným vytěsněním řetězce, OmniPlex, REPLI-g, PicoPLEX, preimplantation genetic analysis, whole-genome amplification, array comparative genomic hybridization, multiple displacement amplification

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 6. 6. 2016
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics