Exprese a lokalizace proteinu CD151 v oocytu prasete

Bc. Helena Kavalcová

Master's thesis

Expression and localization of CD151 protein in porcine oocyte

Abstract:

Membrány všech buněk, s vyjímkou erytrocytů, obsahují tzv. tetraspaninovou síť – funkční oblasti v membráně složené z proteinů. Stejně tak tomu je i v případě oocytů. Mezi tetraspaniny významné pro proces oplození patří zejména molekuly CD9, CD81 a CD151. Pro CD molekuly je typický výskyt v povrchové oblasti oocytu. Cílem předložené diplomové práce bylo detekovat tetraspanin CD151 v oocytu prasete během jeho meiotického zrání. Využita byla metoda Western blot a imunocytochemická detekce. Prasečí kumulo-oocytární komplexy (COCs) byly in vitro kultivovány po dobu 0, 24 a 48 hodin, do stadia zárodečného váčku (GV), první (MI) a druhé meiotické metafáze (MII). Ve vzorcích obsahujících vždy 100 oocytů v daném stadiu meiotického zrání nebo jejich kumulárních buněk byla provedena precipitace proteinů. Pomocí SDS elektroforézy byly proteiny separovány a přetištěny na PVDF membránu. Následovala inkubace s primární a sekundární protilátkou. CD151 protein byl kromě metody Western blot v oocytech ve stadiu GV, MI a MII stanovován rovněž imunocytochemickou metodou za využití laserového konfokálního mikroskopu a jeho množství bylo hodnoceno na základě intenzity signálu reakce protilátky s proteinem. Imunodetekční i imunocytochemická metoda prokázaly přítomnost tetraspaninu CD151 v prasečích oocytech ve všech sledovaných stadiích meiotického zrání – GV, MI i MII, imunodetekcí byl protein detekován také v jejich kumulárních buňkách. Imunocytochemická analýza prokázala, že množství proteinu CD151 je v oocytech ve stadiu zárodečného váčku a první meiotické metafáze srovnatelné, ve druhé meiotické metafázi dochází oproti fázi MI ke statisticky významnému úbytku v množství proteinu. Je známo, že protein CD151 hraje významnou roli během procesu oplození a následné fúze gamet, kterou reguluje prostřednictvím integrinu α6β1. Je možné, že s poklesem množství CD151 V oocytech v MII fázi naopak stoupá množství integrinu α6β1. Tato studie jako první detekovala protein CD151 v prasečím oocytu, pro ověření funkce tohoto proteinu a významu interakce s integrinem pro proces oplození a fúze jsou nezbytné další studie.

Abstract:

Membranes of all cells, with the exception of erythrocytes, contain the so-called tetraspanin network - functional regions in the membrane composed of proteins. The same is true for oocytes. Tetraspanins important for the fertilization process include, in particular, the CD9, CD81 and CD151 molecules. CD molecules are typically found in the surface region of the oocyte. The aim of the presented diploma thesis was to detect tetraspanin CD151 in a porcine oocyte during its meiotic maturation. Western blot and immunocytochemical detection were used. Porcine cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured in vitro for 0, 24 and 48 hours, to the germinal vesicle stage (GV), the metaphase I (MI) and the metaphase II (MII) of meiosis. Protein precipitation was performed in samples each containing 100 oocytes at a given stage of meiotic maturation or their cumulative cells. Using SDS electrophoresis, proteins were separated and reprinted on a PVDF membrane. Incubation with primary and secondary antibody followed. In addition to Western blotting in GV, MI and MII oocytes, CD151 protein was also determined by immunocytochemistry using a laser confocal microscope and its amount was evaluated based on the signal strength of the antibody-protein reaction. Immunodetection and immunocytochemical method proved the presence of tetraspanin CD151 in porcine oocytes in all monitored stages of meiotic maturation - GV, MI and MII, by immunodetection the protein was also detected in their cumular cells. Immunocytochemical analysis showed that the amount of CD151 protein in oocytes in the germinal vesicle stage and the metaphase I stage is comparable, in the metaphase II stage there is a statistically significant decrease in the amount of protein compared to the MI stage. The CD151 protein is known to play an important role during the fertilization and subsequent gamete fusion process, which is regulated by the α6β1 integrin. It is possible that, as the amount of CD151 in oocytes in the MII phase decreases, the amount of α6β1 integrin increases. This study was the first to detect the CD151 protein in a porcine oocyte, and further studies are needed to verify the function of this protein and the importance of the integrin interaction for the fertilization and fusion process.

Keywords

prase, oocyt, protein CD151

Keywords

oocyte, protein CD151, pig

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology