Analýza glykoproteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Bc. Ondřej Bočánek

Master's thesis

Mass spectrometry analysis of glycoproteins

Anotácia:

Předmětem diplomové práce je problematika analýzy glykoproteinů pomocí MALDI-TOF MS. Koncentrační rozsah glykoproteinů v biologickém materiálu, který může být až 12 řádů, není schopna současná instrumentace využívaná pro proteomiku pokrýt. Problémem může být také potlačení ionizace glykoproteinů/glykopeptidů jako minoritní složky vzorku. Z toho důvodu je důležitá jejich frakcionace. Cílem této práce bylo nalézt vhodný frakcionační postup pro analýzu rostinných glykoproteinů. Jako testovací vzorek byl vybrán izolát patatinů (zásobních proteinů z brambor), u kterých byla prokázána přítomnost N-glykosylace. Nejdříve byla vybrána vhodná MALDI matrice pro analýzu glykopeptidů. Poté byly v práci testovány komerční frakcionační kity od společností Novagen, GE Healtcare a Clontech, které však nepřinesly očekávané výsledky. Následně byl otestován postup FASP/FACE s využitím různých lektinů: concanavalinu A, AFL (izolován z Aspergillus fumigatus), RSL (izolován z Ralstonia solanacearum) a BclA (izolován z Burkholderia cenocepacia). Ani jedním z postupů však nebylo dosaženo uspokojivé míry separace či opakovatelnosti. Posledním krokem v této práci byla analýza glykanů za pomoci derivatizační značky fenylhydrazinu, která potvrdila jejich přítomnost ve studovaných izolátech patatinů. Naše výsledky ukázaly, že frakcionace glykopeptidů je velmi citlivou součástí glykoproteomického experimentu, a její zavedení je spojeno s testováním a optimalizací dostupných frakcionačních metod.

Abstract:

This thesis is focused on the analysis of glycoproteins using MALDI TOF MS. Concentration range of glycoproteins in the biological material can be up to 12 orders of magnitude and it is impossible to cover this range with instrumentation currently used in proteomic research. The suppressed ionization of glycoproteins/glycopeptides can also be a problem, as they are minor constituents of the sample. It is therefore necessary to fractionate them. The aim of this work was to find a suitable fractionation procedure for the analysis of plant glycoproteins. As the test sample, an isolate of patatins (potato storage N-glycosylated protein) was selected. First, a suitable MALDI matrix was chosen for the analysis of glycopeptides. Then, the commercial fractionation kits produced by Novagen, GE Healtcare and Clontech were tested, however, they did not yield expected results. Subsequently, the procedure of FASP/FACE was tested, using different lectins: concanavalin A, AFL (isolated from Aspergillus fumigatus), RSL (isolated from Ralstonia solanacearum) and BclA (isolated from Burkholderia cenocepacia). None of these procedures reached a satisfactory degree of separation or repeatability. The final step of this thesis was analysis of glycans by using derivatization by phenylhydrazine, which confirmed presence of glycans in the studied isolates of patatins. Our results showed that the fractionation of the glycopeptides is a very sensitive part of glycoproteomic analysis workflow, and its implementation is associated with the testing and optimization of available fractionation methods.

Kľúčové slová

hmotnostní spektrometrie, MALDI-TOF MS, glykosylace, glykopeptid, glykoprotein, lektin, concanavalin

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2014
• Vedúci: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry