Strukturní organizace domén lidské tyrosin hydroxylasy a její změny po vytvoření komplexu s 14-3-3 proteinem

Bc. Hana Nedozrálová

Master's thesis

Intra-domain organization within the human regulatory domain of tyrosine hydroxylase and in the complex with 14-3-3 protein

Abstract:

Tyrosin hydroxylása je enzym katalyzující hydroxylaci tyrosinu na L-DOPA. Tato reakce je krokem určujícím rychlost biosyntézy katecholaminních neurotransmiterů dopaminu, noradrenalinu a adrenalinu. Aktivita tyrosin hydroxylásy je regulována fosforylací serinů na flexibilním N-konci a tvorbou komplexu s 14-3-3 proteinem. Tyrosin hydroxylása je tetramer, přičemž každá podjednotka je tvořena katalytickou a regulační doménou s flexibilní N-terminální oblastí. Tato diplomová práce má za cíl vyřešit kompletní strukturu lidské tyrosin hydroxylásy isoformy 1 pomocí kryo-elektronové mikroskopie, především vzájemnou orientaci regulačních a katalytických domén. Dále jsme chtěli studovat strukturní změny způsobené fosforylací a vyřešit strukturu komplexu s 14-3-3 proteinem. Diplomová práce představuje dokončenou cryoEM rekonstrukci tyrosin hydroxylásy v apo stavu a dosavadní výsledky pro fosforylované formy a pro komplex s 14-3-3 proteinem. Výzkumná práce zahrnovala purifikaci proteinu, přípravu cryoEM vzorků, sběr dat a také obrazovou analýzu a 3D rekonstrukci tyrosin hydroxylásy.

Abstract:

Tyrosine hydroxylase is an enzyme catalyzing hydroxylation of tyrosine into L-DOPA. This reaction is a rate limiting step in biosynthesis of catecholamine neurotransmitters dopamine, noradrenaline and adrenaline. The activity of tyrosine hydroxylase is regulated by phosphorylation of serine residues on the flexible N-terminus and by formation of a complex with 14-3-3 protein. Tyrosine hydroxylase is a tetramer; each subunit is composed of catalytic domain and regulatory domain with a flexible N-terminal region. This thesis aims to solve the full length structure of human tyrosine hydroxylase isoform 1 by means of cryo-electron microscopy, mainly the mutual orientation of the regulatory and catalytic domains. Also we wanted to study the structural changes caused by phosphorylation and to solve the structure of the complex with 14-3-3 protein. The thesis presents a cryoEM reconstruction of tyrosine hydroxylase in the apo state and partial results for phosphorylated forms and the complex with 14-3-3 protein. The research work covers protein purification, cryoEM sample preparation and data collection as well as image analysis and 3D reconstruction of the tyrosine hydroxylase.

Keywords

tyrosin hydroxylása, 14-3-3 protein, struktura, regulace, fosforylace, komplex, kryo-elektronová mikroskopie, single-particle rekonstrukce, analýza obrazu, tyrosine hydroxylase, structure, regulation, phosphorylation, complex, cryo-electron microscopy, single-particle reconstruction, image analysis

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 12. 6. 2017
• Supervisor: RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry