Detekce patogenů rodu Phytophthora z půdy pomocí izolace kultur a metody NGS

Ing. Aneta Bačová

Doctoral thesis

Detection of Phytophthora pathogens from soil using isolation of cultures and the NGS method

Abstract:

Patogeny rodu Phytophthora jsou celosvětově významnými škodlivými organismy lesních dřevin, které způsobují široké spektrum onemocnění a vysoké ekonomické i ekologické ztráty. Z významných lesních dřevin mají v podmínkách České republiky největší vnímavost pro napadení těmito patogeny buk lesní (Fagus sylvatica) a všechny druhy dubů (Quercus sp.). Jelikož je těmto druhům dřevin v lesnictví přikládán poslední roky čím dál větší význam, je třeba se věnovat rizikům, která pěstování těchto dřevin přináší. Mezinárodní obchod se sadebním materiálem a změna klimatu mají za následek zavlékání nových druhů patogenů do oblastí, kde se dříve nevyskytovaly a dřeviny jim tak nejsou přizpůsobeny. To může mít za následek významné ztráty ať už při pěstování sadebního materiálu, nebo v lesních ekosystémech samotných. Je tedy zapotřebí věnovat pozornost studiu těchto patogenů, jejich výskytu a reakci původních dřevin na napadení těmito patogeny. V první studii byla zkoumána diverzita rodu Phytophthora v osmi lesních a okrasných školkách v České republice. K odhalení rozmanitosti rodu Phytophthora v půdě a závlahové vodě byla použita izolační technika lapání na listy (baiting) a DNA metabarkoding. Celkem byl izolací zjištěn výskyt 12 druhů fytoftor v 59,4 % z odebraných vzorků půdy. Ve dvou školkách byla provedena dodatečná izolace baitingem z kompostu a byly získány dva druhy rodu Phytophthora. V jedné z těchto školek to byla P. gonapodyides, která nebyla detekovaná v půdě. Ve druhé ze školek byl detekován druh P. cryptogea, který se hojně vyskytoval i v půdních vzorcích odebraných z několika hostitelských dřevin. Závlahová voda byla zkoumána ve třech školkách baitingem nebo přímou izolací z částečně rozložených plovoucích listů odebraných z vodního zdroje a byly získány dva druhy fytoftor. DNA metabarkoding vzorků půdy, který patří mezi metody sekvenování DNA nové generace (NGS) byl proveden ve dvou školkách z půdy, v jednom případě i ze závlahové vody. Vzorky ze školek (z vody i půdy celkem) byly identifikovány jako 45 taxonů Phytophthora, z toho 15 dosud neznámých taxonů z kladů 6, 7, 8 a 9. Dalších 11 taxonů patřilo ke známým nebo nepopsaným druhům rodů oomycet Globisporangium, Hyaloperonospora, Nothophytophthora, Peronospora a Plasmopara. Celkově bylo oběma technikami detekováno 50 taxonů Phytophthora, přičemž pět taxonů (P. taxon organica, P. plurivora, P. rosacearum, P. syringae a P. transitoria) bylo detekováno výhradně pomocí baitingu a 38 pouze pomocí DNA metabarkodingu. Obzvláště časté druhy detekované metabarkodingem byly P. cinnamomi a P. lateralis, které ale nebyly potvrzeny pomocí baitingu. Oběma technikami bylo detekováno pouze sedm druhů. Ke stanovení skutečné diverzity fytoftor v umělých nebo přírodních ekosystémech a odhalení přítomnosti vzácných nebo nových taxonů je tedy doporučeno použít kombinaci obou technik. Po infekci rostliny fytoftorou následují histologické, fyziologické a metabolické změny, ale dosud jen velmi málo studií zkoumalo všechny tyto procesy současně a v souvislostech. V druhé studii byly sazenice Fagus sylvatica inokulovány izoláty s párovacími typy A1 a A2 heterothalického druhu P. ×cambivora a homothalickým druhem P. plurivora, aby bylo možno identifikovat fyziologické změny odehrávající se v infikovaných rostlinách. Průběh infekce byl sledován také pomocí mikroskopického sledování procesu kolonizace vždy jeden, dva a tři týdny po inokulaci. Rostliny infikované Phytophthora plurivora odumřely rychleji než rostliny naočkované P. ×cambivora. Výsledky ukazují, že P. plurivora je k semenáčkům Fagus sylvatica celkově agresivnější než oba párovací typy P. ×cambivora. Pro pochopení širší

Abstract:

ho kontextu infekcí způsobených patogeny rodu Phytophthora je zahrnuta i studie, kdy byly provedeny průzkumy diverzity tohoto rodu ve 25 přírodních a polopřírodních lesních porostech a 16 řekách v mírných a subtropických horských a tropických nížinných ekosystémech Vietnamu. Za použití metody izolace kultur ze vzorků půdy a řek a přímých izolací z přirozeně spadaného listí, bylo získáno 13 již popsaných druhů, pět neformálně určených taxonů a 21 dříve neznámý taxonů rodu Phytophthora. Většina nalezených druhů, včetně P. ramorum, nebyla spojena se zjevnými příznaky onemocnění. Z toho vyplývá, že se Vietnam nachází v centru původu většiny nalezených taxonů.

Abstract:

Pathogens of the genus Phytophthora are globally important harmful organisms of forest trees, causing a wide spectrum of diseases and high economic and ecological losses. In the Czech Republic, beech (Fagus sylvatica) and all oak species (Quercus spp.) are the most susceptible to the infections caused by these pathogens. Because the increasing importance of these trees is expected in current forestry, it is necessary to pay attention to the risks associated witht the growing and survival of these trees. International trade and climatic changes results in the introduction of pathogens in new areas, where the local tree species are not adapted to them. This can result in significant losses either in the production of nursery stock or in the forest ecosystems. Therefore, it is necessary to pay attention to the investigation of these pathogens, their occurrence and the reaction of native trees to attack caused by these pathogens. Phytophthora diversity was examined in eight forest and ornamental nurseries in the Czech Republic. A leaf baiting isolation technique and DNA metabarcoding (Illumina) belonging among the next generation sequencing (NGS) methods were used to reveal the diversity of Phytophthora in soil and irrigation water and to compare the efficacy of both methods. In total, baiting revealed the occurrence of 12 Phytophthora taxa in 59.4 % of soil samples. Additional baiting of compost was carried out in two nurseries and two Phytophthora species were recovered. Irrigation water was examined in three nurseries by baiting or by direct isolation from partially decomposed floating leaves collected from the water source, and two Phytophthora species were obtained. Metabarcoding of soil and water samples was done in two and one nurseries, respectively. Phytophthora reads were identified as 45 Phytophthora taxa, 15 of them previously unknown taxa from Clades 6, 7, 8 and 9. Another 11 taxa belonged to known or undescribed species of the oomycete genera Globisporangium, Hyaloperonospora, Nothophytophthora, Peronospora and Plasmopara. In total, 50 Phytophthora taxa were detected with both techniques. Of them, five taxa (P. taxon organica, P. plurivora, P. rosacearum, P. syringae and P. transitoria) were exclusively detected by baiting and 38 others by DNA metabarcoding only. Especially P. cinnamomi and P. lateralis were particularly common in metabarcoding records but were not isolated by baiting. Only seven species were detected by both techniques. Therefore, the combination of both techniques is recommended to determine diversity of Phytophthora in managed or natural ecosystems and reveal the presence of rare or unknown Phytophthora taxa. Phytophthora infections are followed by histological alterations, physiological and metabolomic adjustments in the host but very few studies contemplate these changes simultaneously. During the second research activity, Fagus sylvatica seedlings were inoculated with the heterothallic P. ×cambivora (both A1 and A2 mating types) and the homothallic P. plurivora to identify plant physiological changes of the colonization process. The infection process was evaluated by microscope observations one, two and three weeks after inoculation. - Plants infected by Phytophthora plurivora were more rapidly killed m than those inoculated with P. ×cambivora. Phytophthora ×cambivora A1 and A2 caused similar progression and total rate of mortality. The results indicate that P. plurivora is more aggressive to Fagus sylvatica seedlings than both mating types of P. ×cambivora. To understand the broader context of infections caused by pathogens of the genus Phytophthora, the third study is also included where surveys of the diversity of this genus were carried out in 25 natural and semi-natural forest stands and 16 rivers in temperate and subtropical mountain and tropical lowland regions of Vietnam. Using the method of culture isolation from soil and river samples and direct isolations from naturally falle

Abstract:

n leaves, 13 already described species, five informally designated taxa and 21 previously unknown taxa of the genus Phytophthora were obtained. Most of the species found, including P. ramorum, were not associated with obvious disease symptoms. The results indicate that Vietnam is located in the center of origin of most of the taxa found.

Keywords

oomycety, choroby rostlin, půdní mikrobiom, kořenové patogeny, infekce, diverzita, spektrální odrazivost, DNA metody, biogeografie

Keywords

plant diseases, infestation, DNA techniques, biogeography, oomycetes, root pathogens, diversity, spectral reflectance, soil microbiome

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 7. 2024

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Michal Tomšovský, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of Forestry and Wood Technology

Doctoral programme / field:
Botany / Forest Phytology