Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb s důrazem na potenciální patogeny

Hana KAŇKOVÁ

Bachelor's thesis

Molecular characterization of selected amoeba strains with emphasis to potential pathogens

Abstract:

Jako cíle práce jsem si zvolila: vypracování literární rešerše, která bude zaměřena na volně žijící améby jako patogeny lidí a zvířat, molekulární charakterizaci vybraných sbírkových kmenů améb, kdy získám sekvence genů využívaných jako markery pro tyto organismy (SSU rDNA, ITS). Data získaná sekvenací fylogeneticky analyzovat a výsledky analýz interpretovat. V teoretické části jsem se zabývala základní morfologií potenciálně patogenních améb (akantaméb a neglérií), jejich patogenitou a krátce i možnostmi léčby jimi způsobených onemocnění (primární amébová meningoencefalitida, granulomatózní amébová meningoencefalitida, amébová keratitida). Akantaméby i neglérie (Naegleria fowleri a různé druhy akantaméb) jsou schopny invadovat lidský organismus, zejména významná je jejich schopnost pronikat do mozku, kde mohou způsobit amébovou meningoencefalitidu (onemocnění CNS). Primární amébová meningoencefalitida (PAM) je způsobena N. fowleri. Onemocnění se vyskytuje hlavně u dětí a mladých dospělých, kteří se koupali (potápěli) v trvale oteplené vodě, v níž tento druh améby nacházíme. Améba vstupuje do těla přes nosní dutinu. PAM má rychlý průběh člověk zpravidla umírá do 7 dní od projevení se prvních příznaků. Granulomatózní amébová encefalitida (GAE) je způsobena zejména druhy rodu Acanthamoeba. Onemocnění je chronického charakteru (probíhá i několik měsíců). Nalézáme ho u imunokompromitovaných lidí (diabetes, HIV/AIDS, drogová závislost apod.) Do těla se akantaméba dostane skrz poranění a do CNS putuje hematogenní cestou. Dalším onemocněním způsobeným rodem Acanthamoeba je amébová keratitida (AK). AK je zánět rohovky. Akantaméba se do oka dostane většinou prostřednictvím nedostatečně sterilizované kontaktní čočky nebo při traumatu rohovky. Léčba chorob způsobených amébami je velmi komplikovaná a ne vždy úspěšná. Rozdíly mezi akantamébami a neglériemi se týkají několika oblastí životního cyklu, velikosti a patogenity. Na rozdíl od neglérií, které jsou schopny vytvořit 3 stádia (trofozoit, bičíkovec, cysta), akantaméby přecházejí jen mezi dvěma stádii (trofozoit, cysta). Trofozoit akantaméb (12-35 ?m) je v porovnání s tím neglériovým (15-25 ?m) o něco větší. Nejvýraznější rozdíly jsou vidět na cystách, které jsou u akantaméb nepravidelného tvaru, zatímco u neglérií kulovité a hladké. V praktické části své práce jsem se pokusila zodpovědět několik otázek, zejména blíže určit, do kterých genotypů resp. druhů patří mnou studované améby a zjistit bližší údaje o jejich potenciální patogenitě, geografickém rozšíření atp. V metodické části jsem popsala postup kultivace vybraných améb, získávání DNA, průběh PCR, elektroforézu a softwarové zpracování výsledných sekvencí. Pro kultivaci jsem používala klasický nevýživný agar a améby sklízela po jejich vizuální kontrole. Průběh PCR byl standardní s využitím specifických primerů a termocykleru. Výsledný PCR produkt jsem použila pro elektroforézu. Po vyřezání odpovídajících proužků gelu, jsem je odeslala na sekvenaci do specializované firmy (Macrogen). Výsledné sekvence jsem prohlédla a ty s kvalitním signálem zpracovala pomocí programů SeqMan, ClustalX, BioEdit. Pro fylogenetickou analýzu jsem využila programů Paup, RAxML a MrBayes. Podařilo se mi získat celkem 9 sekvencí genu pro SSU rRNA akantaméb a jednu sekvenci negleriové ITS. Pomocí fylogenetické analýzy jsem získala fylogenetické stromy, které jsem začlenila do kapitoly výsledky. Na kapitolu výsledky jsem navázala v diskusi. Nastínila jsem problém při získávání neglériových sekvencí a navrhla některá řešení. V další části diskuse jsem se věnovala podrobnější analýze fylogenetických strom

Abstract:

ů. Některé z mnou získaných sekvencí vykazují blízkou příbuznost se sekvencemi odvozenými z akantaméb izolovaných z pacientů s AK z různých oblastí světa, což naznačuje, že rozšíření některých potenciálně nebezpečných linií améb je globální. Neglériové sekvence jsou více omezeny prostředím, ale existují zde i výjimky.

Abstract:

Goals of my work are: preparation of literature review, which will focus on free living amoebas as pathogens of humans and animals, molecular characterization of selected collection strains of amoebas: obtaining sequences of genes used as markers for these organisms (SSU rDNA, ITS). Data got by sequencing will be phylogenetically analyzed and results of analyzes interpreted. In the theoretical part I described the basic morphology of potentially pathogenic amoebas (acantamoebas, naegleriae), their pathogenicity and briefly also treatment of these diseases (primary amebic meningoencephalitis, granulomatous amebic encephalitis, acanthamoeba keratitis). Acanthamoebas and naeglerias (Naegleria fowleri and various species of acanthamoebas) are capable of entering human organism. Especially important is their ability to penetrate into brain, where they can be cause of amebic meningoencephalitis (disease of CNS). Primary amebic meningoencephalitis (PAM) is caused by N. fowleri. The diaseas occurs in children and young adults, who bathed in a permanently warmed water, where this species is found. Amoeba enter the body through the nasal cavity. PAM has rapid course human die within 7 days from first symptoms. Granulomatous amebic encephalitis (GAE) is caused by Acanthamoeba spp. The disease has a chronic character (its duration is up to several months). It is found in immunocompromised people (diabetes, HIV/AIDS, drug addiction ect.) Acanthamoebas enter through an injury and go to CNS by hematogenous route. Another disease caused by genus Acanthamoeba is acanthamoeba keratitis (AK). AK is inflammation of cornea. Acanthamoeba come in to the eye through contaminated contact lenses or when cornea is damaged. Treatment these diseases is very complicated and success rate is not high. Differences between acanthamoebas and naeglerias concern several areas life cycle, size and pathogenic potential. Naeglerias are able to create 3 stages (trophozoite, flagellate, cyst), acanthamoebas alternate between 2 stages (trophozoit, cyst). Trophozoite of acanthamoebas (12-35 ?m) is somewhat bigger in comparsion with naegleria (15-25 ?m). Major differences are visible on cysts which are irregular in shape in acanthamoebas and spherical and smooth in naeglerias. In the practical part of my work I try to answer several questions: determination of genotypes or species of amoebas that were isolated and to ascertain more information about their pathogenity, geographic range etc. In the methodical part I described procedures of cultivation of amoebas, isolation of their DNA, course of PCR, electrophoresis and software processing of sequences. In cultivation I used classic non-nutrient agar and amoebas were harvested after their visual checking.The PCR protocol was standard: I used specific primers and termocycler. PCR products were separated by electrophoresis. After cutting proper bands from the gel, I sent the sample to be sequenced by a specialized company (Macrogen). Final sequences were checked and sequences with high quality signal were processed by programs SeqMan, ClustalX, BioEdit. For phylogenetic analysis I used programs Paup, RAxML and MrBayes. I got 9 sequences of genes for SSU rRNA of acanthamoebas and 1 naegleria´s ITS sequence. Using phylogenetic analysis I got phylogenetic trees which I inserted to chapter with results. In the discussion chapter I outlined problems during gaining of naegleria´s sequences. The next part of discussion is devoted to detailed analysis of phylogenetic trees. Some of my sequences show close association with sequences derived from acanthamoebas which were isolated from patients with AK from various regions of the world, which indicate global distribution of some lineages of amoebas. Naegleria groups are more restricted by environment, but there are exceptions.

Keywords

Acanthamoeba, Naegleria, Primární amébová meningoencefalitida, Granulomatózní amébová encefalitida, PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2015

Accessible from:: 5. 5. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Martin Kostka, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician