Centrosomal abnormalities in human embryonic stem cells

PharmDr. Zuzana Holubcová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Potenciální terapeutické užití lidských embryonálních (EK) buněk doprovází obavy z možného rizika vzniku nádoru in vivo. Lidské EK buňky dlouhodobě propagované in vitro totiž podléhají genetickým změnám, jejichž výsledkem může být nádorová transformace. Chromozomální nestabilita řady nádorů je spojena s výskytem přespočetných centrozomů, které mají za následek nerovnoměrné rozdělení genetického materiálu během buněčného dělení. Naše studie jako vůbec první poukazuje na to, že kultury lidských EK buněk se vyznačují zvýšeným počtem buněk s numerickými aberacemi centrozomů. Vysoká frekvence mitotických buněk s abnormálním počtem centrozomů je typická pro nediferencovaný stav lidských EK buněk a výskyt postižených mitoz klesá během dlouhodobé kultivace pluripotentních buněk. Zlepšení kvality kultivačního povrchu, stejně jako inhibice klíčových regulátorů centrozomálního metabolizmu CDK2 a Aurora A, vede k omezení centrozomální amplifikace v lidských EK buňkách. To znamená, že nedostatečná buněčná adheze i deregulace centrozomálního metabolizmu se podílí na hyperamplifikaci centrozomů v lidských EK buňkách. Stanovení stupně ploidie multicentrozomálních mitoz a analýza centrozomů/centriol v buňkách nacházejících se v G1 fázi buněčného cyklu vedly k odhalení, že nejenom nepřiměřená centrozomální duplikace, ale i akumulace centrozomů po předchozím nedokončeném buněčném dělení, představují zdroje nadbytečných centrozomů v lidských EK buňkách. Abnormální mitotická dělení iniciovaná přespočetnými centrozomy se pak mohou stát zdrojem genetické nestability v kulturách lidských EK buněk.

Abstract:

One pertinent concern regarding the use of human embryonic stem cells (hESCs) as a therapeutic tool is a possible risk of ch romosomal variation and/or even tumor formation in vivo. When continuously propagated in vitro, hESCs tend to accumulate multiple changes to their genome. Chromosomal instability in cancer cells is considered to be driven, at least in part, by centrosomal overamplification perturbing balanced chromosome segregation. Our study provides the first evidence that cultured hESCs develop numerical abnormalities to their centrosomes. High frequency of supernumerary centrosomes in mitoses features undifferentiated state and becomes progressively suppressed upon prolonged propagation of hESCs in culture. Improvement of adhesive conditions as well as targeting of key regulators of centrosome metabolism, CDK2 and Aurora A, is effective to reduce percentage of cells with multiple centrosomes in mitosis suggesting that both attenuated cell attachment and deregulation of machinery controlling centrosome numbers account for centrosomal overamplification in hESCs. As determined by evaluation of ploidy of multicentrosomal mitoses and centrosome/centriole status in G1 phase cells, not only organelle overduplication but also mitotic failure contribute to generation of abnormal centrosome number in hESCs. Our data point to the supernumerary centrosomes as another significant risk factor for cultured hESCs in terms of maintenance of genome integrity.

Keywords

Human embryonic stem cells, centrosome, chromosomal instability, cell cycle, CDK2, Aurora A lidské embryonální kmenové buňky, centrozom, chromozomální nestabilita, buněčný cyklus, Aurora A

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 11. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 17. 12. 2010
• Supervisor: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology