Vývoj metody pro purifikaci a kvantifikaci silně bazického peptidu apidaecinu. Analýza hladiny včelích antimikrobiálních peptidů a jejich biologických souvislostí.

Mgr. Jiří DANIHLÍK

Doctoral thesis

Mechanism of regulation of honey bee humoral immunity

Abstract:

U hmyzu, stejně jako i u jiných organismů, se vyvinul imunitní systém, jehož cílem je chránit jedince před nepříznivými vlivy z prostředí, kde jsou vystaveny tlaku patogenů. Imunitní systém sestává ze tří úrovní individuální ochrany: 1) fyzikální bariéry, 2) buněčná imunita, 3) humorální imunita, u sociálního hmyzu, ke kterému patří i včela medonosná (Apis mellifera) pak i sociální imunita. Antimikrobiální peptidy jsou významnou součástí humorální složky imunitního systému, protože potlačují růst mikroorganismů, nacházejí se v hemolymfě včel, jedu, v mateří kašičce i v medu. Antimikrobiální peptidy jsou produkovány hlavně tukovým tělesem, dále pak hemocyty a buňkami střeva. Mezi jejich zástupce patří apidaeciny produkované právě do hemolymfy. Produkce apidaecinů je silně stimulována bakteriálními infekcemi. Dosud provedené studie vlivu jak patogenů, tak i dalších případných modulátorů tvorby apidaecinů, např. pesticidů, byly sledovány pouze na úrovni exprese genů pomocí molekulárně biologických metod, avšak metoda pro absolutní kvantifikaci samotného aktivního peptidu v tělech nebo dílčích tkáních včel dosud nebyla popsána. Pro kvantifikaci apidaecinů bylo potřeba vyvinout citlivou analytickou metodu a současně vyřešit problém rychlých ztrát silně bazických apidaecinů během zpracování vzorků i práce se standardy. Optimalizovaný protokol zahrnuje zpracování vzorků včel nebo jejich tkání homogenizací a tepelnou denaturaci balastních proteinů přítomných v homogenátu. Purifikace apidaecinů využívá iontoměničové chromatografie na slabém katexu v laboratorně připravených kolonkách z GELoader špiček a vhodného chromatografického sorbentu. Frakce obsahující isoformy apidaecinu 1 je dále přečištěna a odsolena v tzv. Stage Tip kolonkách s reverzní fázi typu C8. Purifikovaná frakce isoforem apidaecinu 1 je dělena nanoprůtokovou kapalinovou chromatografií na koloně s reverzní fází (C4) ve spojení s detekcí vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem. Optimalizovaná metoda má návratnost ~45%, a přesnost <10 % při hladině peptidu 0,1 pmol. Kalibrace vykazuje lineární rozsah v rozmezí 0 5 pmol, limit detekce je ~50 fmol, limit kvantifikace pak 0,1 pmol. Metoda využívá kvantifikace s interním standardem, kterým je [13C615N4] apidaecin 1A značený na C-koncovém argininu. Koncentrace isoforem apidaecinu 1 v hemolymfě jednotlivých zdravých včel byla 13,0 ng/?l (95% konfidenční interval, CI: 7,5 18,6 ng/?l). Hrudníky zdravých úlových včel obsahovaly 36,2 ng/hrudník (95% CI: 18,953,6 ng/hrudník) a hlavy 12,9 ng/hlavu (95% CI: 9,116,7 ng/hlavu). Pro měření relativní exprese genů kódujících apidaeciny a abaecin byla zavedena a optimalizována metoda kvantitativní PCR ve vzorcích včel. Metoda zahrnuje izolaci celkové RNA, přepis do cDNA a samotnou qPCR reakci pro stanovení relativní exprese. Byly validovány vybrané provozní geny (Arp1, EF1a-F2) a použity pro stanovení relativní exprese genů apidaecinů a abaecinu. Zavedené metody kvantifikace hladiny isoforem apidaecinu 1 a exprese genů pro apidaeciny a abaecin byly využity pro studium vlivu složení potravy na tyto faktory humorálního imunitního systému. Výsledky studie ukazují, že proteinová výživa je nutná pro vývoj hrudníku i pro produkci isoforem apidaecinu 1. Medián koncentrace isoforem apidaecinu 1 byl 0,2 ng/mg hrudníku (95% CI: 0 0,4 ng/mg) u včel krmených 18 dní neproteinovou výživou, zatímco v hrudnících včel krmených proteinovou výživou byl medián koncentrace peptidu 2,2 ng/mg (95% CI: 1,8 2,6 ng/mg). Krmení včel různou proteinovou výživou, případně pylem jako hlavním zdrojem proteinů ve výživě včel, však indukuje i rozdílnou expresi genů apidaecinů i abaecinu v tkáni zadečku dospělých včel, kde se n

Abstract:

acházejí buňky tukových těles. Optimalizovaná metoda kvantifikace isoforem apidaecinu 1 může být využita při výzkumu imunity včel a zároveň může posloužit jako modelová strategie kvantifikace jiných silně bazických peptidů.

Abstract:

Insects, as well as other organisms, have immune systems to survive in the environment, and to defend themselves from pathogens. Honey bee innate immunity consists of three levels of individual responses: 1) physical barriers, 2) cellular immunity, 3) humoral immunity, and because honey bees are social insects, they have developed also social immunity level. Antimicrobial peptides are important part of humoral immunity, because they are able to supress bacterial growth. They were detected in the hemolymph, sting, royal jelly and honey. Antimicrobial peptides are produced mainly in fat bodies and also in hemocytes and intestine cells. Apidaecins belong to the antimicrobial peptide family and are secreted into the hemolymph. Production of apidaecins is stimulated by bacterial challenges. The effects of pathogens, pesticides or other possible immune modulators have been studied only by molecular biology methods so far, whereas a method for the absolute quantification of apidaecins in bee bodies or tissues has been missing. It was necessary to develop a sensitive analytical method for quantification and in parallel to solve problems with rapid losses of highly basic apidaecins occurring during sample preparation. The optimized protocol comprises of bee samples preparation by homogenization and heat denaturation of ballast proteins present in the homogenate. The purification of apidaecin is based on ion-exchange chromatography on weak cation exchanger in lab-made columns from GELoader tips filled with a chromatographic sorbent. The enriched apidaecin 1 isoforms fraction is purified and desalted on C8 Stage Tips. The purified fraction is separated by a nanoliquid chromatography on C4 reverse phase column connected on line with a high-resolution mass spectrometer. The recovery of the method is ~45%, precision <10 % at 0.1 pmol level. Calibration is linear in range 0 5 pmol. The limit of detection is ~50 fmol, limit of quantification 0.1 pmol. Internal standard [13C615N4] apidaecin 1A labeled on arginine at C-end is used as internal standard. The concentration of apidaecin 1 isoforms is 13.0 ng/?l (95% confidence interval, CI: 7.5 18.6 ng/?l) in hemolymph. Thoraces contain 36.2 ng/unit (95% CI: 18.953.6 ng/unit) and heads 12.9 ng/unit (95% CI: 9.116.7 ng/unit). A quantitative PCR protocol was optimized for measuring the relative expression of genes coding apidaecins and abaecin in bee samples. The method includes RNA isolation, reverse transcriptase reaction for cDNA synthesis and finally the qPCR for determination of relative gene expression. Housekeeping genes (Arp1, EF1a-F2) were validated and then used for relative quantification of gene expressions of apidaecins and abaecin. Validated method for apidaecin 1 isoforms and relative expression of genes for apidaecins and abaecin were employed in the research of bee nutrition and its´ effect on humoral immunity. The obtained results confirmed that protein diet is important for thorax development and for production of apidaecin 1 isoforms. Honey bees fed sugar only for 18 days had median of apidaecin 1 isoforms 0.2 ng/mg of thorax (95% CI: 0 0.4 ng/mg), whereas thoraces of bees fed protein diet had median 2.2 ng/mg (95% CI: 1,8 2.6 ng/mg). Various pollen diets as a natural source of protein or protein supplement induce different gene expressions of genes for apidaecins and abaecin in bee abdomens, where fat bodies produce them. The optimized method for apidaecin 1 isoforms quantification will be applied in honey bee research and can be considered as a proof of concept for quantification of other highly basic peptides.

Keywords

Antimikrobiální peptidy, včela medonosná, vrozená imunita, apidaecin, abaecin, výživa včel

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 10. 2015

Accessible from:: 19. 10. 2015

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry