Studium fototoxických a fotoprotektvních účinků přírodních látek

Mgr. Alena RYŠAVÁ

Disertační práce

Study of Phototoxic and Photoprotective Effects of Natural Substances

Anotace:

Disertační práce byla zaměřena na studium působení UVA záření ve vztahu k signální dráze řízené transkripčním faktorem Nrf2 v kožních buňkách a účinky vybraných přírodních látek z ostropestřce mariánského na uvedenou signální dráhu v samotných kožních buňkách a buňkách vystavených účinku UVA záření. Úvodní část práce se zabývala strukturou lidské kůže, slunečním zářením, které je zodpovědné za řadu nežádoucích účinků v lidské kůži a současnými poznatky o signální dráze řízené transkripčním faktorem Nrf2 se zaměřením na jeho strukturu, funkci a regulaci jeho aktivity a vlivu UV záření a přírodních látek na tento transkripční faktor v kůži. V závěru úvodní části byly shrnuty znalosti o biologické aktivitě silymarinu (SM), extraktu ze semen ostropestřce mariánského, a vybraných flavonolignanů: silybinu (SB), isosilybinu (ISB), 2,3-dehydrosilybinu (DHSB), silychristinu (SC), silydianinu (SD), a flavonoidů: taxifolinu (TA) a kvercetinu (KV) ve vztahu k UV záření. Velká část experimentů byla věnována studiu účinků UVA záření na signální dráhu řízenou transkripčním faktorem Nrf2 v primárních lidských kožních fibroblastech a keratinocytech a buněčné linii keratinocytů HaCaT. Výsledky ukázaly, že odezva jednotlivých buněk na UVA záření se liší jak při porovnání fibroblastů a keratinocytů, tak při srovnání primárních keratinocytů a linie HaCaT. Translokace Nrf2 do jádra byla u ozářených keratinocytů HaCaT a fibroblastů rychlejší a intenzivnější ve srovnání s primárními keratinocyty. U fibroblastů byla většina sledovaných parametrů zvýšená až po 24 h. U primárních keratinocytů byly změny patrné v dřívějších časových intervalech po UVA expozici. Změny sledovaných parametrů pozorované u ozářených keratinocytů HaCaT byly odlišné od změn v primárních keratinocytech. Studium stability ukázalo, že SM a vybrané čisté polyfenolové látky kromě flavonolignanu DHSB a flavonoidu KV jsou až na některé výjimky stabilní v etanolu a fosfátových pufrech s různým pH při zvolených teplotách a dobách inkubace. Nestabilita KV byla větší ve srovnání s DHSB. Při expozici polyfenolů UVA záření bylo zjištěno, že SM, SB, ISB, SC, SD i TA jsou fotostabilní. Naopak DHSB a KV vykazovaly fotonestabilitu, která se zvětšovala s rostoucí dávkou UVA záření a v přítomnosti kyslíku. Aplikace SM a vybraných polyfenolových látek vyvolala u všech buněčných modelů (primární fibroblasty, keratinocyty a buňky HaCaT) zvýšenou translokaci proteinu Nrf2 do jádra. U SM i většiny látek byl pozorován výraznější efekt při nejnižší použité koncentraci 6,25 ?mol/l. Nejvyšší míra translokace proteinu Nrf2 do jádra byla nalezena účinkem KV. Tento flavonoid také měl největší schopnost ovlivnit změny v jaderné lokalizaci proteinu Nrf2 a expresi podřízených cytoprotektivních a antioxidačních genů NAD(P)H:chinonoxidoreduktázy 1 a hemoxygenázy 1 v primárních kožních buňkách vystavených UVA záření. Ostatní polyfenoly a SM byly méně účinné. V součinnosti s univerzitou ve Štrasburku bylo také prokázáno, že SM je schopen potlačit senescenci u prasečích endotelových buněk. Souhrnně lze konstatovat, že SM a většina testovaných polyfenolů je stabilní a fotostabilní s výjimkou KV a DHSB a všechny látky a SM jsou schopny zvyšovat hladinu/obsah proteinu Nrf2 v jádře. I vzhledem k dřívějším poznatkům by SM i obsahové složky mohly sloužit jako fotoprotektivní látky, nicméně jejich efekt musí být dále ověřen in vivo. Stejně tak bezpečné použití KV a DHSB musí být ověřeno, nejlépe v in vivo podmínkách, protože u nich může při dlouhodobém používání převážit nežádoucí prooxidační efekt nad ochranným.

Abstract:

The PhD thesis deals with the study of effect of UVA radiation in relation to the signalling pathway controlled by the Nrf2 transcription factor in skin cells and the effect of selected natural compounds from milk thistle on the Nrf2 signalling pathway in the skin cells unexposed and exposed to UVA radiation. The first part characterizes the structure of human skin and sunlight, which is responsible for a number of harmful effects on human skin. Further the current knowledge about the signalling pathway controlled by the Nrf2 transcription factor with the focus on its structure, function, regulation of its activity, and the effect of UV radiation and natural compounds on the Nrf2 signalling pathway in skin cells is summarized. The introduction also describes known biological effects of silymarin (SM), the extract of milk thistle, and selected flavonolignans: silybin (SB), isosilybin (ISB), 2,3-dehydrosilybin (DHSB), silychristin (SC), silydianin (SD), and flavonoids: taxifolix (TA) and quercetin (QE), which were studied in this thesis. The emphasis was given on effects in relation to UV radiation. The large part of the experiments focused on the study of UVA effects on the Nrf2 signalling pathway in primary and the HaCaT keratinocyte cell line. The results showed that the response of individual cells to UVA radiation differs when comparing fibroblasts and keratinocytes and when comparing primary keratinocytes and the HaCaT line. The Nrf2 translocation into the nucleus was faster and more intense in UVA-irradiated HaCaT keratinocytes and fibroblasts compared to primary keratinocytes. In fibroblasts, most of the monitored parameters were increased after 24 h. In primary keratinocytes, changes were evident in earlier time intervals after UVA exposure. The changes observed in UVA-irradiated HaCaT keratinocytes were different from those induced in primary keratinocytes. The stability study showed that SM and selected pure polyphenolic compounds except flavonolignan DHSB and flavonoid QE, are with some exceptions, stable in ethanol and phosphate buffers with different pH at selected temperatures and incubation times. QE instability was greater compared to DHSB. When polyphenols were exposed to UVA radiation, SM, SB, ISB, SC, SD, and TA are photostable. In contrast, DHSB and QE showed photodecomposition, which was augmented with an increasing dose of UVA radiation and in the presence of oxygen. Treatment with SM and selected polyphenols increased Nrf2 translocation into the nucleus in all cell models (primary fibroblasts, keratinocytes and HaCaT cell line). For SM and most substances, a more pronounced effect was observed at the lowest concentration used (6.25 ?mol/l). The highest rate of Nrf2 translocation into the nucleus was found in QE. This flavonoid also showed the greatest ability to stimulate changes in the nuclear localization of Nrf2 protein and the expression of Nrf2-driven cytoprotective and antioxidant genes NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 and heme oxygenase 1 in primary skin cells exposed to UVA radiation. Other polyphenols and SM were less effective. In collaboration with the University of Strasbourg, SM was also shown to supress senescence in porcine endothelial cells. In summary, SM and most of the polyphenols tested are stable and photostable except for QE and DHSB and all substances and SM are able to increase the content of Nrf2 protein in the nucleus. In the view of previous and here obtained knowledge, SM and the selected components could serve as photoprotective agents, however, their effect must be further verified in vivo. Likewise, the safe use of QE and DHSB must be verified, preferably in vivo, as the pro-oxidative effect may outweigh the protective effect in their long-term use.

Klíčová slova

UVA záření, oxidační stres, silymarin, ostropestřec mariánský, flavonolignany, flavonoidy, primární lidské kožní fibroblasty, primární lidské kožní keratinocyty, linie lidských keratinocytů HaCaT, transkripční faktor Nrf2, NAD(P)H, chinonoxidoreduktáza 1, hemoxygenáza 1, stabilita, fotostabilita

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 10. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Alena Rajnochová Svobodová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská chemie a klinická biochemie / Lékařská chemie a klinická biochemie