Viola odorata L.: Identification and Characterization of Na+,K+-ATPase Inhibiting Component

Bc. Tomáš HEGER

Master's thesis

Abstract:

Members of the Viola genus play important roles in traditional Asian herbal medicine. This work investigates the ability of Viola odorata L. extracts to inhibit Na+,K+-ATPase, an essential animal enzyme responsible for membrane potential maintenance. The root extract of V. odorata strongly inhibited Na+,K+-ATPase, while leaf and seeds extracts were basically inactive. A UHPLC-QTOF-MS/MS metabolomic approach was used to identify the chemical principle of the root extract's activity, resulting in the detection of 35 292 features. Candidate active compounds were selected by correlating feature area with inhibitory activity in 14 isolated fractions. This yielded a set of 15 candidate compounds, of which 14 were preliminarily identified as procyanidins. Commercially available procyanidins (B1, B2, B3 and C1) were therefore purchased and their ability to inhibit Na+,K+-ATPase was investigated. Dimeric procyanidins B1, B2 and B3 were found to be inactive, but the trimeric procyanidin C1 strongly inhibited Na+,K+-ATPase with an IC50 of 4.5 umol L-1. The p-nitrophenyl phosphatase activity of the enzyme was inhibited even more with an IC50 of 0.56 umol L-1. The interaction of the compound and Na+,K+-ATPase was studied using anthroyl ouabain and eosin in several fluorescence experiments. This newly discovered inhibitor was docked into crystal structures mimicking the Na3E1P-ADP and K2E2.Pi states to identify potential interaction sites within Na+,K+-ATPase. Possible binding mechanisms and the principle responsible for the observed root extract activity are discussed.

Abstract:

Zástupci rodu Viola mají důležitou roli v tradiční bylinné medicíně Asie. V této práci je zkoumána schopnost extraktu Viola odorata L. inhibovat Na+,K+-ATPasu, zvířecí enzym zodpovědný za udržování membránového potenciálu. Extrakt z kořene V. odorata silně inhiboval Na+,K+-ATPasu, zatímco extrakt ze semen nebo listů byl neúčinný. K identifikování chemického principu zapříčiňujícího aktivitu extraktu kořene byla provedena metabolomická UHPLC-QTOF-MS/MS analýza, ve které bylo detekováno 35 292 features. Kandidátní aktivní sloučeniny byly selektovány na základě korelace plochy features a biologické aktivity 14 izolovaných frakcí extraktu. Ze souboru 15 kandidátních sloučenin bylo 14 předběžně identifikováno jako procyanidiny. Následně byla proto zkoumána inhibice Na+,K+-ATPasy komerčně dostupnými procyanidiny (B1, B2, B3 a C1). Dimerní procyanidiny B1, B2 a B3 byly neaktivní, avšak trimerní procyanidin C1 silně inhiboval Na+,K+-ATPasu s IC50 4,5 umol L-1. Ještě silněji byla inhibována p-nitrofenylfosfatasová aktivita enzymu s IC50 0,56 umol L-1. Interakce sloučeniny s Na+,K+-ATPasou byla zkoumána pomocí několika fluorescenčních experimentů za využití prób eosinu a anthroylouabainu. Nově objevený inhibitor byl dokován do krystalových struktur mimikujících Na3E1P-ADP a K2E2.Pi stavy enzymu, aby bylo možné identifikovat potenciální interakční místa s Na+,K+-ATPasou. Byl diskutován možný vazebný mechanismus inhibitoru a princip stojící za pozorovanou aktivitou extraktu kořene.

Keywords

Na+, K+-ATPasa, Viola odorata L., metabolomika, UHPLC-QTOF-MS/MS, procyanidin, flavan-3-ol, inhibitor, molekulový docking

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 24. 5. 2021
• Supervisor: Mgr. Jiří Grúz, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry