Dynamics of Telomeric Proteins

Mgr. Eliška Janoušková, Ph.D.

Doctoral thesis

Anotácia:

Dizertační práce je zaměřena na popis mechanismu jak telomerové proteiny udržují stabilitu genomu prostřednictvím ochrany konců chromozomů. Práce je rozdělena do dvou částí. Hlavní část dizertační práce se věnuje shelterinovým proteinům TRF2 (Telomeric Repeat binding Factor 2) a Rap1 (Repressor activator protein 1). Lidský proteinový komplex shelterin, složený z několika podjednotek, se selektivně váže k telomerové DNA a mění její prostorové uspořádání tvorbou specifických lasovitých struktur. Shelterin tak chrání telomery před jejich rozpoznáním jako dvouvláknové zlomy a před následnou aktivací drah signalizujících poškození a zajišťujících opravu DNA. Shelterin rovněž ovlivňuje přístup telomerázy a dalších enzymů k DNA, čímž kontroluje délku telomer. Tímto způsobem shelterinové proteiny regulují stabilitu telomer a podílejí se tak na procesech buněčného stárnutí a nádorové transformace buněk. Abychom pochopili, jak protein Rap1 ovlivňuje klíčové funkce proteinu TRF2, zkoumali jsme vazbu proteinu Rap1 k TRF2 a dále interakce komplexu TRF2 Rap1 s dvouvláknovou DNA a s DNA obsahující přechod mezi jednovláknovým a dvouvláknovým úsekem pomocí kvantitativních biochemických přístupů. Měření založená na anizotropii fluorescence, izotermální titrační kalorimetrii a gelové elektroforéze odhalila, že přítomnost proteinu Rap1 reguluje schopnost proteinu TRF2 vázat a rozpoznávat telomerovou DNA. Protein Rap1 snižuje celkovou vazebnou afinitu proteinu TRF2 k DNA, ale zároveň zvyšuje selektivitu proteinu TRF2 k telomerové DNA. Zvýšená selektivita TRF2 k telomerové DNA je způsobena menší elektrostatickou přitažlivostí mezi TRF2 a DNA v přítomnosti proteinu Rap1. Kromě toho, naše výsledky ukazují, že protein Rap1 částečně uvolňuje TRF2 z DNA duplexu. Protein Rap1 tak zlepšuje selektivní rozpoznání telomerové DNA zprostředkované proteinem TRF2 a může iniciovat přemístění proteinu TRF2 k jeho preferovanému úseku telomerové DNA, který obsahuje přechod mezi jedním a oběma vlákny. Na základě vlastních kvantitativních analýz a dostupných strukturních dat jsme navrhli mechanismus, kterým protein Rap1 ovlivňuje vazbu TRF2 k telomerové DNA. V navrženém mechanismu Rap1 stíní bazickou doménu TRF2, čímž snižuje nespecifické interakce TRF2 s DNA, a tak přispívá k lepšímu rozpoznávání telomer. Navíc jsme popsali, jak bazická doména TRF2 a protein Rap1 ovlivňují stabilitu D-smyčky. Druhá část této práce se zabývá proteinovým heterodimerem Ku70/80. Protein Ku je nezbytný při opravách dvouvláknových zlomů pomocí klasického nehomologního spojování konců (c NHEJ); Ku navíc zajišťuje stabilitu telomer. Z toho důvodu se předpokládá, že ochrana telomer a c-NHEJ vyžadují odlišné mechanismy, při kterých Ku interaguje s DNA. V rámci této práce byl popsán vliv DNA interakčních aminokyselin na celkovou vazbu proteinu Ku na DNA, což přispělo k objasnění klíčového mechanismu, který rozlišuje aktivitu Ku na telomerách od jeho aktivity na dvouvláknových zlomech. Celkově dizertační práce ukazuje účinné vyžití kvantitativních přístupů pro popis interakcí proteinů a DNA při odhalování molekulárního mechanismu ochrany lidských telomer.

Abstract:

This thesis is focused on the description of molecular mechanisms how telomeric proteins maintain genome stability by protection of chromosome ends. The thesis is divided into two parts. The major part of this thesis is focused on shelterin proteins TRF2 (Telomeric Repeat binding Factor 2) and Rap1 (Repressor activator protein 1). Shelterin is multi-subunit human protein complex that selectively binds telomeric DNA and alters its spatial arrangement by formation of specific loop structures. Shelterin thus protects telomeres from being recognized as double-strand breaks and subsequent activation of DNA damage signaling and repair pathways. Furthermore, shelterin controls telomere length by affecting telomerase and other enzyme access to DNA. In this way, shelterin proteins regulate telomere stability and participate in the processes of cell aging and tumor cell transformation. To understand how Rap1 affects key functions of TRF2, we investigated Rap1 binding to TRF2 and TRF2-Rap1 complex interactions with double-stranded DNA and single/double-strand DNA junction by quantitative biochemical approaches. Measurements based on fluorescence anisotropy, isothermal titration calorimetry and gel electrophoresis revealed that the presence of Rap1 modulates TRF2 ability to bind and recognize telomeric DNA. Rap1 reduces the overall DNA-binding affinity of TRF2 on one hand, however increases the selectivity of TRF2 to telomeric DNA on the other hand. The improved TRF2 selectivity to telomeric DNA is caused by less pronounced electrostatic attractions between TRF2 and DNA in Rap1 presence. Additionally, our results demonstrate that Rap1 induces a partial release of TRF2 from DNA duplex. Thus, Rap1 improves selective recognition of telomeric DNA by TRF2 and might prompt the relocation of TRF2 to the preferred single/double-strand region junction of telomeric DNA. Based on our quantitative analyses and available structural data we have suggested a mechanism of how Rap1 affects TRF2 binding to telomeric DNA. We proposed that Rap1 shields the basic domain of TRF2 thereby reduces non-specific interaction of TRF2 with DNA and thus Rap1 contributes to the improved recognition of telomeres. Furthermore, we described how the basic domain of TRF2 and also Rap1 affect D loop stability. The second part of this thesis deals with the protein heterodimer Ku70/80. Ku is essential for repair of double-strand breaks via the classical non homologous end joining (c NHEJ), but Ku is also critical for telomere stability. Therefore, it was assumed that telomere protection and c NHEJ require distinct mechanisms through which Ku interacts with DNA. In this thesis we described the effects of DNA interacting amino acids on overall DNA-binding affinity of Ku, which has contributed to elucidate the key mechanism that distinguishes Ku’s activity at telomeres from its activity at double-strand breaks. In summary, this thesis shows that the description of protein and DNA interactions by quantitative approaches is effective for revealing of molecular mechanisms of human telomere protection.

Keywords

DNA, telomery, proteiny, shelterin, interakce, TRF2, Rap1, helikáza, D-loop, Ku, telomeres, proteins, interactions, helicase

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 10. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 12. 2016
• Vedúci: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Oponent: prof. RNDr. Ľubomír Tomáška, DrSc., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics