CRISPR/Cas9 v editaci genomu Brassica sp.

Bc. Jana Zemánková

Master's thesis

CRISPR/Cas9 in genome editing of Brassica sp.

Abstract:

CRISPR/Cas9 je v dnešní době nejmodernější molekulárně-biologickou metodou šlechtění rostlin. Touto metodou můžeme způsobit cílené mutace v námi zvolených genech a umožňuje nám tak rychlejší a specifičtější šlechtění, než nám nabízí dosavadní klasické šlechtící postupy. Tato práce je zaměřena na tvorbu konstruktů pro metodu CRISPR/Cas9, které způsobí mutace v genech zapojených do biosyntézy auxinů, konkrétně se jedná o geny TAA1. Ověření funkce konstruktů bylo provedeno metodou hairy roots na modelové rostlině Brassica napus. V další části práce byl transformován reportérový promotor pro hladinu auxinů, DR5v2:n3mTurquoise2, do B. napus. Pomocí tohoto promotoru můžeme sledovat hladinu auxinů v rostlinném těle. Vytvořené transgenní rostliny budou v budoucnu využity na sledování změn hladin auxinů v důsledku mutací způsobených metodou CRISPR/Cas9. Jelikož jsou dosavadní protokoly pro regeneraci transformovaných explantátů rostliny B. napus velmi zdlouhavé, třetí část této práce je zaměřena na jejich optimalizaci, především se věnuje složení živných médií. Vhodná média pro iniciaci růstu kalusů jsou obohacena o přídavek fipexidu a cytokininů, pro indukci prýtu je to přídavek dusičnanu stříbrného v kombinaci s fytohormony auxiny a cytokininy.

Abstract:

CRISPR/Cas9 is one of the most popular molecular method in breeding. This approach allows us to create target mutations in chosen genes and it provides us with a quick and specific breeding solution in comparison with clasical breeding methods. In this thesis, constructs for the CRISPR/Cas9 method will be created in order to cause mutation in auxin biosynthesis genes. The functionality is verified by hairy roots method on model plant Brassica napus. In the next part of the thesis, reporter promotor for auxin level, DR5v2:n3mTurquoise2, was transformed into B. napus. Using this promotor, we can monitor the level of auxins in the plant body. These transgenic plants will be used in the future for monitoring changes in auxin level due to mutation caused by CRISPR/Cas9. Due to time demands of current protocols for regeneration of transformed plant explants of B. napus, the third part of this thesis is focused on their optimization, especially by dealing with composition of nutrient media. In this thesis, suitable media for cali initiation with addition of fipexide and cytokinins was tested, and for shoot induction media, the addition of AgNO3 with phytohormones cytokinins and auxins is recommended.

Keywords

CRISPR/Cas9, Brassica napus, Modular Cloning, auxiny, DR5v2

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 8. 7. 2020
• Supervisor: Ph.D. Helene Robert Boisivon

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology